細胞膜リン脂質によって制御される物質輸送と情報伝達の関係の解析

细胞膜磷脂控制的物质运输与信息传递关系分析

基本信息

批准号：
16791128
负责人：
竹内弘
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では細胞内輸送経路が細胞内情報伝達の特異性発現に寄与する可能性をリン脂質代謝経路との関わりに的を絞って検証した。昨年度より、種々の膜脂質の細胞内局在の解析に利用するため、PH、PXドメインを中心に様々な結合特異性を有する脂質結合性蛋白質モジュールの発現コンストラクトを作製、精製蛋白質を用いた結合特異性の確認を行った。その過程でPA(phosphatidic acid)/PI(3)P両者に特異性を持つPXドメインを新たに見出した。他のPXドメインの構造解析結果を参考にアミノ酸点突然変異を加えることでこのPXドメインのPI(3)P結合能が失われ、PAにのみ結合するプローブが得られた。これを蛍光蛋白質EGFPとの融合蛋白質としてCOS7細胞に発現させると、EGF、PMA刺激依存的なエンドソーム膜への移行が観察された。PA産生酵素であるPLDを共発現させるとこのプローブと外来PLDはエンドソーム膜上に共局在したことから、同プローブの細胞刺激依存的な局在変化はPAを認識したものと確認した。このPA特異的プローブは細胞に過剰発現させるとPAの下流シグナルに対してdominant negativeに作用した。すなわち褐色細胞腫細胞株PC12のEGF刺激や線維芽細胞Rat1のPDGF刺激によるErkのリン酸化がこのプローブの過剰発現により抑制された。これらの結果は受容体刺激に伴う情報伝達は形質膜直下のみを反応の場とするのではなく、細胞内の輸送小胞上で特定の下流分子群(この場合Raf-1などのPAの下流分子)と反応することで細胞形質膜直下とは異なる伝達反応を行っていることを示唆するものであり、冒頭の仮説を裏付ける証拠を提供するものである。これらの結果はThe 4^<th> Japan-Korea Conference on Cellular Signaling for Young Scientists(福岡・2005年7月)にて口演発表した。

在这项研究中，细胞内转运途径有助于细胞内信息传播的特殊表达的可能性集中在与磷脂代谢途径的关系上。从去年开始，为了使用各种结合特性，基于脂质的蛋白质模块表达构建体（主要是pH和PX结构域）用于在各种膜脂质细胞中进行分析，我们确认了特异性。在此过程中，我发现了两个p的新的PX域（磷脂酸）/pi（3）。通过添加氨基酸点突变，参考其他PX结构域的结构分析结果，丢失了该PX结构域的PI（3）P键能力，并且仅获得了仅与PA结合的探针。当在COS7细胞中以荧光蛋白EGFP的融合蛋白表达时，观察到向EGF和PMA -stimuli依赖性末端膜的过渡。当强调的是Pa产生的酶的PLD时，该探针和门诊PLD位于末端倒入中，因此探针中探针依赖性的部分变化被识别为PA。当细胞过度表达细胞时，该PA特异性探针对PA的下游信号的主要负作用。也就是说，通过该探针的过度表达抑制了EGF刺激和PDGF刺激ERK的磷酸化和PDGF刺激PC12的成纤维细胞Rat1。这些结果不仅直接在过境膜下，而且仅用于与受体刺激相关的信息传播，而是下游分子（在这种情况下，在PAS的下游（例如RAF-1））。是与细胞转化下方的不同传播反应，并提供了证据以支持一开始的假设。这些结果是在年轻科学家的4^<th>日本 - 库里亚蜂窝信号会议上宣布的（福冈，2005年7月）。