遺伝子導入動物から迫る概日時計の新規構成分子

来自转基因动物的生物钟的新组成分子

基本信息

批准号：
15687002
负责人：
岡野俊行
金额：
$ 17.47万
依托单位：
Waseda University (2005)The University of Tokyo (2003-2004)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (A)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

交付申請書に記載の研究実施計画に沿って研究を遂行し、下記の成果を得た。研究代表者らはこれまでに、概日時計の位相が前進する際にニワトリ松果体においてmRNAが誘導される新規分子を同定した。この分子をLCGと命名し、全長cDNAのクローニング・特異的抗体の作成ならびに強制発現系における細胞内局在の解析等を行ったところ、LCGは中心体のマーカーであるγチューブリンと共局在することが分かった。そこで次に、LCGが松果体においてγチューブリンと相互作用する可能性を免疫沈降法を用いて検討した。その結果、LCGとγチューブリンの結合が確認された。これらの結果から、LCGは時刻シグナルにしたがい中心体の活性を制御している分子である可能性が示唆された。LCGの解析と並行し、新しい光同調経路の発見を目指し、新規光受容分子を探索した。その結果、ニワトリゲノム中に、青色光受容タンパク質であるクリプトクロームの類似遺伝子が存在することを見いだした。これをcCRY4と命名し、cCRY4に関する解析を行った。その結果、cCRY4のmRNAは、網膜および松果体などの光感受性の概日時計組織に多く発現しており、培養した松果体細胞中においてmRNA量が光依存的に上昇することが判った。そこで、cCRY4を特異的に認識する抗体を作成し、タンパク質発現を調べたところ、松果体の多数の実質細胞および一部の間質細胞に存在することが判った。さらに、タンパク質発現もmRNAの発現量と同様の光依存的変動を示すことや、分画した細胞抽出液の水溶性画分中にcCRY4が検出されることがわかった。これらの結果から、cCRY4は光感受性の概日時計組織において青色光を受容する新規の光受容分子であり、ピノプシン等をはじめとする既知の光受容分子とは全く異なる光情報伝達経路に関与している可能性が強く示唆された。

本研究按照资助申请中所述的研究实施计划进行，取得了以下成果。主要研究人员之前已经发现了一种新分子，当生物钟相位提前时，其 mRNA 在鸡松果体中被诱导。我们将这个分子命名为 LCG，在克隆全长 cDNA、创建特异性抗体并分析其在强制表达系统中的细胞内定位后，我们发现 LCG 与 γ-微管蛋白（中心体的标记物）共定位。确实如此。接下来，我们使用免疫沉淀研究了 LCG 与松果体中 γ-微管蛋白相互作用的可能性。其结果，确认了LCG与γ-微管蛋白的结合。这些结果表明LCG可能是一种根据时间信号控制中心体活动的分子。在分析 LCG 的同时，我们寻找新的光感受器分子，目的是发现新的光调节途径。结果，他们发现鸡基因组中存在一种类似于隐花色素（一种蓝光受体蛋白）的基因。我们将此命名为 cCRY4 并分析了 cCRY4。结果发现，cCRY4 mRNA在视网膜和松果体等光敏感生物钟组织中高表达，并且在培养的松果体细胞中mRNA的量以光依赖性方式增加。因此，我们创建了一种特异性识别cCRY4的抗体，并检测了其蛋白表达，发现它存在于松果体的许多实质细胞和一些间质细胞中。此外，发现蛋白质表达也显示出与mRNA表达水平相似的光依赖性波动，并且在分级细胞提取物的水溶性级分中检测到cCRY4。这些结果表明，cCRY4是一种在光敏感生物钟组织中接收蓝光的新型光感受器分子，并且强烈表明它参与与已知的光感受器分子（例如pinopsin）完全不同的光学信息转导途径。