時刻情報の生成・制御を支える転写因子群の発現プログラム

支持时间信息生成和控制的转录因子表达程序

基本信息

批准号：
15011213
负责人：
岡野俊行
金额：
$ 2.69万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

交付申請書に記載の研究計画に従い研究を遂行し、以下の知見を得た。【1】タンパク質レベルからの概日時計の発振プログラム解読これまでに同定した時計関連分子のうちA78およびE4BP4に重点をおき、蛋白質レベルでの解析を行った。その結果、A78は培養細胞中において中心体に局在することが判明した。概日時計の発振における中心体の役割は不明であるが、概日時計による細胞周期制御に関与する可能性が想定される。一方、E4BP4はニワトリ松果体において夕刻に限って転写が光誘導されるため、光位相後退に関わっている可能性を検討した。その結果、E4BP4蛋白質の発現に顕著なサーカディアンリズムが見られること、夕刻の光刺激によってmRNAレベルに加えて蛋白質量も増大することが判明した。さらに、時計関連キナーゼとして注目されているカゼインキナーゼによってE4BP4がリン酸化を受け、リン酸化によりプロテオソーム依存的に分解されることがわかった。これらの発見は、時計発振においてE4BP4が「いつ、どこで、何を」しているのかという時計発振プログラムの一端を明らかにしたものと言える。【2】個体レベルからの概日時計のリセットプログラム解読個体レベルにおける概日時計のリセットプロセスを解明するために、時計中枢の一つである松果体において時計機能を破壊したゼブラフィッシュの作製を試みた。まず、時計発振の中心的役割を担うBMAL分子のC末端領城を欠失した変異蛋白質を用い、これが時計発振に対してドミナントネガティブ効果を示すことを見いだした。次に、この変異BMAL蛋白質の遺伝子に松果体特異的プロモータを繋ぎ、松果体に変異BMALを発現するトランスジェニックゼブラフィッシュを作製した。その結果、変異遺伝子導入系統として複数のゼブラフィッシュ系統を樹立することに成功した。

该研究按照资助申请中所述的研究计划进行，并获得以下结果。 [1] 从蛋白质水平破译生物钟的振荡程序在目前鉴定出的生物钟相关分子中，我们重点关注A78和E4BP4，并在蛋白质水平上对其进行分析。结果发现，A78 定位于培养细胞的中心体。尽管中心体在生物钟振荡中的作用尚不清楚，但推测它们可能参与生物钟对细胞周期的控制。另一方面，由于 E4BP4 的转录仅在晚上在鸡松果体中被光诱导，因此我们研究了它参与光相延迟的可能性。结果显示，E4BP4蛋白的表达存在明显的昼夜节律，晚上的光刺激不仅增加了mRNA水平，而且增加了蛋白量。此外，我们发现E4BP4被作为时钟相关激酶而受到关注的酪蛋白激酶磷酸化，并且磷酸化导致其以蛋白酶体依赖性方式降解。这些发现可以说澄清了时钟振荡程序的一部分：E4BP4在时钟振荡中“何时、何地、做什么”。 [2] 从个体层面解读生物钟重置程序为了阐明个体层面的生物钟重置过程，我们在松果体（我尝试过的生物钟中心之一）中创造了生物钟功能被破坏的斑马鱼。首先，我们使用了一种突变蛋白，其中在时钟振荡中起核心作用的BMAL分子的C端区域被删除，并发现这种突变蛋白对时钟振荡具有显性负效应。接下来，将松果体特异性启动子连接到该突变 BMAL 蛋白的基因，以创建在松果体中表达突变 BMAL 的转基因斑马鱼。结果，我们成功建立了多个斑马鱼品系作为突变基因导入品系。