脳に存在する生物時計細胞のリアルタイム追跡と光情報伝達機構

大脑生物钟细胞实时追踪及光学信息传输机制

基本信息

批准号：
10169213
负责人：
岡野俊行
金额：
$ 1.6万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

交付申請書に記載の研究実施計画に沿って研究を進め、以下の知見を得た。【概日時計細胞の時刻情報可視化】顕微鏡観察下において連続的に灌流培養しながらニワトリ松果体細胞・ラット視交叉上核細胞を分散培養するシステムを完成した。次に個々の細胞の時刻を蛍光強度として検出するため、転写量が日周変動するマウスper1遺伝子のプロモーター領域をクローニングした。この下流に短寿命型GFPの遺伝子(d2EGFP)を繋ぎレポーターコンストラクトを作製した。【時計や光応答に関連する遺伝子の単離】松果体細胞を用いたディファレンシャルディスプレイ解析を行い、時刻依存的に転写される遺伝子を探索した。その結果、分子シャペロンの一種であるHSP90遺伝子の転写量が日周変動することを見出した。【松果体・脳深部の光情報伝達経路と時計発振系の解析】ニワトリ松果体Gαの全一次構造決定に続いて、松果体のG蛋白質が光受容蛋白質ピノプシンと共存すること、Gt_1αおよびG_<11>αが光刺激依存的に光受容蛋白質から解離することを明らかにした。これらのことから、Gt_1を介した既知の光情報伝達経路の他に、G_<11>αを介した全く新しい経路が存在することが強く示唆された。これと並行して、概日時計への光入力系にチロシンリン酸化蛋白質が関与している可能性を検討した。その結果、松果体MAPキナーゼが光刺激の直後に脱リン酸化されること、さらにMAPキナーゼのチロシンリン酸化量および活性は恒暗条件下においても概日リズムを示すことがわかった。また、MEKの阻害剤(PD98059)を培養松果体に投与すると、概日時計の位相シフトが観察された。これらのことから、MAPキナーゼは概日時計を構成する分子であり、MAPキナーゼの活性化・不活性化のサイクルは、概日時計が駆動するために必要であることが明らかになった。

本研究按照资助申请中所述的研究实施计划进行，并获得以下研究结果。 [生物钟细胞时间信息可视化] 我们完成了在显微镜观察下连续灌注培养分散鸡松果体细胞和大鼠视交叉上核细胞的系统。接下来，为了检测单个细胞中一天中的时间作为荧光强度，我们克隆了小鼠per1基因的启动子区域，该基因的转录水平每日波动。通过连接其下游的短寿命 GFP 基因 (d2EGFP) 创建报告构建体。 [与时钟和光反应相关的基因的分离] 我们使用松果体细胞进行差异显示分析，以寻找以时间依赖性方式转录的基因。结果，他们发现HSP90基因（一种分子伴侣）的转录水平每天都会波动。【松果体/大脑深部光学信息传递通路及时钟振荡系统分析】随着鸡松果体Gα整个一级结构的测定，我们发现松果体G蛋白与光感受器蛋白pinopsin共存， Gt_1α 可知G_ 11 α和G_ 11 α以光刺激依赖性方式与感光蛋白解离。这些结果强烈表明，除了已知的由Gt_1介导的光学信息传递途径之外，还存在由G_<11>α介导的全新途径。与此同时，我们研究了酪氨酸磷酸化蛋白参与生物钟光输入系统的可能性。结果，我们发现松果体MAP激酶在光刺激后立即去磷酸化，并且即使在持续黑暗的情况下，MAP激酶的酪氨酸磷酸化的量和活性也表现出昼夜节律。此外，当对培养的松果体施用MEK抑制剂（PD98059）时，观察到生物钟的相移。这些发现表明，MAP激酶是构成生物钟的分子，并且MAP激酶的激活/失活循环对于生物钟的运行是必需的。