耐塩性乳酸菌分子シャペロンの機能発現によるスーパーストレス耐性生物の分子育種

耐盐乳酸菌分子伴侣功能表达超耐逆生物分子育种

• 批准号: 04J06799
• 负责人: 杉本 真也
• 金额: $ 1.79万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-04J06799/
• 关键词: 分子シャペロン; タンパク質フォールディング; 耐塩性; 乳酸菌; ストレス耐性; 分子育種; 構造・機能解析; 耐塩性乳酸菌; 微生物工学; 分子生物学; 分子シャペロン; タンパク質フォールディング; 耐塩性; 乳酸菌; ストレス耐性; 分子育種; 構造・機能解析; 耐塩性乳酸菌; 微生物工学; 分子生物学

耐塩性乳酸菌Tetragenococccus halophilus由来の種々の分子シャペロンの構造および機能の詳細を明らかにした。T.halophilus ClpB (ThaClpB)に関しては、精製タンパク質を用いた生化学的解析結果より、ThaClpBの4次構造が熱や塩などの環境ストレス、あるいはATPの結合により変化し、それに伴い機能が変化することを明らかにした(J.Bacteriol.2006)。次に、T.halophilus DnaK (ThaDnaK)と大腸菌由来DnaKの機能を比較しながら、ThaDnaKの分子機構を明らかにした。一般的にDnaKはコシャペロンDnaJ、GrpEによりATP加水分解サイクルが活性化され、それに伴う構造変化により基質タンパク質との結合・解離を繰り返し、効率よく基質タンパク質のフォールディングを行う。しかし、精製タンパク質を用いたATPase活性測定、変性タンパク質リフォールディング活性測定および表面プラズモン共鳴バイオセンサーによる相互作用解析の結果から、ThaDnaKは大腸菌とは異なりDnaJおよびGrpEと協調的に機能しないことが示唆された。このような特性は他の乳酸菌にも見られ、大腸菌などに比べて乳酸菌のシャペロン機能は弱いことが示唆された(J.Bacteriol.へ投稿中)。さらに、大腸菌などのグラム陰性細菌にはT.halophilusやその他グラム陽性細菌にはない23アミノ酸残基の挿入配列がDnaKのATPaseドメインに存在し、その部位がDnaJおよびGrpEと協調的に機能する上で重要であることを示した(FEBS Lett.へ投稿中)。上記の成果より、乳酸菌の分子シャペロンシステムをより強力・高効率なものへと改変することで、高いストレス耐性能を有する有用乳酸菌の分子育種が可能であると考えられた。そこで、乳酸発酵、バクテリオシン生産などにおいて使用されてきた乳酸菌Lactococcus lacis subsp.lactisをモデルとし、分子シャペロンの機能強化によるストレス耐性能の向上を目指した。ThaDnaK発現株と大腸菌DnaK発現株についてはすでに構築済みであり、現在DnaK以外の分子シャペロン発現株および複数の分子シャペロン共発現株を構築している。これら分子シャペロン機能強化株のストレス耐性能および発酵生産性の向上が期待される。

已经详细揭示了源自耐盐的乳酸菌四局局部的各种分子伴侣的结构和功能。关于谷链球菌CLPB（THACLPB），使用纯化蛋白质的生化分析表明，由于环境应激（如热和盐）或ATP的结合，THACLPB的第四纪结构发生了变化，并且功能会发生相应的变化（J.Bacteriol。2006）。接下来，我们通过比较了halolophilus dnak（Thadnak）和E. coli-derdive dnak的功能来揭示Thadnak的分子机制。通常，DNAK用Coochaperones DNAJ和GRPE激活ATP水解循环，所得的结构变化反复结合并与底物蛋白结合，从而有效地折叠了底物蛋白。然而，使用纯化的蛋白质，变性蛋白质重折叠活性测量以及使用表面等离子体等离子体共振生物传感器的相互作用分析的ATPase活性测量结果表明，与大肠杆菌不同，Thadnak与DNAJ和GRPE不合时宜。这些特性在其他乳酸菌中也可以看到，这表明乳酸细菌的伴侣功能比大肠杆菌等的伴侣弱（张贴在j.bacteriol上）。此外，在革兰氏阴性细菌（例如大肠杆菌）中，在DNAK的ATPase结构域中存在23个氨基酸残基和其他革兰氏阳性细菌的插入序列，其位点在与DNAJ和GRPE合作中起作用很重要（发布在febs中。基于上述结果，人们认为，通过将乳酸细菌的分子伴侣系统修改为更强大且高效的方式，可以培养具有高应激性的有用的乳酸细菌。因此，我们旨在使用乳酸菌乳酸菌亚种来通过增强分子伴侣的功能来提高抗压力性。乳酸，已用于乳酸发酵和细菌素的产生，作为模型。已经构建了表达Thadnak的表达菌株和表达大肠杆菌DNAK的菌株，目前，非DNAK分子伴侣表达菌株和多个分子伴侣共表达菌株。预计这些分子伴侣增强菌株的应力抗性和发酵生产力将得到改善。