アミロイドーシスの発症を誘導する腸内細菌由来機能性アミロイドの探索

寻找源自肠道细菌的功能性淀粉样蛋白，诱导淀粉样变性的发生

基本信息

批准号：
20K21291
负责人：
杉本真也
金额：
$ 4.08万
依托单位：
Jikei University School of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-07-30 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は、特定の腸内細菌が産生する機能性アミロイドが腸管などの末梢組織から中枢神経や全身に移行し、宿主のアミロイド前駆体タンパク質の構造変換を触媒することで、神経変性疾患を発症させるという新たな仮説を検証することである。前年度までの研究により、パーキンソン病患者において優位に増加することが報告されているCatabacter属細菌の機能未知タンパク質が、大腸菌の機能性アミロイドCurliの構成タンパク質CsgAと低いながらも相同性を示すことを見出し、本タンパク質をCatabacter amyloid-like protein A（CalA）と命名した。CalA遺伝子にCsgAのシグナルペプチド（1-20）および外膜輸送タンパク質CsgGの認識部位（21-43）を連結したキメラ遺伝子を合成し、大腸菌で複製可能なプラスミドのIPTG誘導型プロモーターの下流に連結することで、CalA発現プラスミドを構築した。そしてCurliの産生をネガティブに制御する複数の因子を欠損させた株にCalA発現プラスミドを導入し、コンゴーレッド含有培地上でアミロイド線維の産生を評価した。その結果、CalA発現プラスミド導入株のコロニーが微弱ながら赤色を呈した。Alpha-Fold 2を用いてCalAの立体構造を予測したところ、CalAのN末端は天然変性領域であり、C末端側に4本のβストランドからなるβシート構造を形成することが示唆されたため、CalAのC末端ペプチド（CalA-C）を化学合成し、アミロイド線維を形成するかを検証した。その結果、チオフラビンT蛍光の増大が認められ、透過電顕観察により、枝分かれのない線維構造を形成することがわかった。さらに、CalA-Cをもとに作製したアミロイド様線維をSeedとして、CalA-Cモノマーの凝集体形成が促進されることを明らかにした。

这项研究的目的是检验新的假设，即特异性肠细菌产生的功能性淀粉样蛋白可以从外周组织迁移到中枢神经系统和整个身体，从而催化宿主淀粉样蛋白前体蛋白的结构转化，从而导致神经脱发性疾病。直到上一年的研究发现，据报道，在帕金森氏病患者中主要增加了核细菌属细菌的功能蛋白，与CSGA表现出低的同源性，CSGA是一种功能性淀粉样蛋白的蛋白质，在Escherichia coli中的蛋白质组成，蛋白质蛋白质被称为catabacter catabacter amyloid amyyloId amyyloid蛋白（cala）蛋白（cala）。合成了一个嵌合基因，其中CSGA信号肽（1-20）和外膜转运蛋白CSGG（21-43）的识别位点与Cala基因相关，Cala表达质粒是通过将ITPTG诱导型纤溶酶质化的下游构成的。然后，将CALA表达质粒引入了一种菌株中，该菌株缺乏多种因素，这些因素会对质质的产生产生负面调节，并在含有刚果红色的培养基上评估淀粉样蛋白纤维的产生。结果，引入表达CALA的质粒的菌落显示出略微的红色。当使用Alpha折2预测CALA的3D结构时，建议CALA的N末端是一个天然变性的区域，并且它形成了由C-terminus侧的四个β链组成的β-折叠结构，因此我们研究了Cala C-C-C-tensaltal肽（Cala-c）是否是化学综合的。结果，观察到硫非类T荧光的增加，通过观察透射电子显微镜，发现形成了没有分支的纤维结构。此外，据揭示了基于Cala-C产生的淀粉样蛋白样纤维被用作种子来促进Cala-C单体聚集体的形成。