アミロイドーシスの発症を誘導する腸内細菌由来機能性アミロイドの探索

寻找源自肠道细菌的功能性淀粉样蛋白，诱导淀粉样变性的发生

基本信息

批准号：
20K21291
负责人：
杉本真也
金额：
$ 4.08万
依托单位：
Jikei University School of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-07-30 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は、特定の腸内細菌が産生する機能性アミロイドが腸管などの末梢組織から中枢神経や全身に移行し、宿主のアミロイド前駆体タンパク質の構造変換を触媒することで、神経変性疾患を発症させるという新たな仮説を検証することである。前年度までの研究により、パーキンソン病患者において優位に増加することが報告されているCatabacter属細菌の機能未知タンパク質が、大腸菌の機能性アミロイドCurliの構成タンパク質CsgAと低いながらも相同性を示すことを見出し、本タンパク質をCatabacter amyloid-like protein A（CalA）と命名した。CalA遺伝子にCsgAのシグナルペプチド（1-20）および外膜輸送タンパク質CsgGの認識部位（21-43）を連結したキメラ遺伝子を合成し、大腸菌で複製可能なプラスミドのIPTG誘導型プロモーターの下流に連結することで、CalA発現プラスミドを構築した。そしてCurliの産生をネガティブに制御する複数の因子を欠損させた株にCalA発現プラスミドを導入し、コンゴーレッド含有培地上でアミロイド線維の産生を評価した。その結果、CalA発現プラスミド導入株のコロニーが微弱ながら赤色を呈した。Alpha-Fold 2を用いてCalAの立体構造を予測したところ、CalAのN末端は天然変性領域であり、C末端側に4本のβストランドからなるβシート構造を形成することが示唆されたため、CalAのC末端ペプチド（CalA-C）を化学合成し、アミロイド線維を形成するかを検証した。その結果、チオフラビンT蛍光の増大が認められ、透過電顕観察により、枝分かれのない線維構造を形成することがわかった。さらに、CalA-Cをもとに作製したアミロイド様線維をSeedとして、CalA-Cモノマーの凝集体形成が促進されることを明らかにした。

这项研究的目的是将特定肠道细菌产生的功能性淀粉样蛋白从肠道等周围组织转运到中枢神经系统和全身，并催化宿主体内淀粉样前体蛋白的结构转变，从而预防神经退行性变目的是检验导致癌症发生的新假设。去年进行的研究表明，卡塔杆菌中的一种功能未知的蛋白质（据报道在帕金森病患者中显着增加）与埃希氏菌功能性淀粉样蛋白 Curli 的组成蛋白 CsgA 具有较低的同源性。这种蛋白质被命名为 Catabacter 淀粉样蛋白 A (CalA)。合成了CsgA信号肽(1-20)和外膜转运蛋白CsgG(21-43)的识别位点与CalA基因连接的嵌合基因，并将其连接在IPTG诱导型启动子的下游。可以在大肠杆菌中复制的质粒通过这样做，构建了CalA表达质粒。然后，将CalA表达质粒引入缺乏负调节Curli产生的多种因子的菌株中，并在含有刚果红的培养基上评估淀粉样原纤维的产生。结果，导入CalA表达质粒的菌株的菌落呈现淡红色。当使用 Alpha-Fold 2 预测 CalA 的三维结构时，表明 CalA 的 N 末端是自然变性区域，而 C 末端形成由四个 β 链 We 组成的 β 折叠结构。化学合成了CalA的C端肽（CalA-C）并验证其是否形成淀粉样原纤维。结果，观察到硫黄素T荧光增加，透射电子显微镜显示它形成了无支化的纤维结构。此外，还表明，使用基于CalA-C制备的淀粉样蛋白样原纤维作为种子，促进了CalA-C单体聚集体的形成。