ニワトリB細胞株を利用する抗体の分子進化システムの構築と応用

鸡B细胞系抗体分子进化体系的构建及应用

基本信息

批准号：
15760589
负责人：
金山直樹
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15760589/
关键词：
分子進化工学タンパク質工学抗体 DT40 遺伝子変換

项目摘要

本研究は、DT40細胞の抗体遺伝子改変能力を利用して、抗体の分子進化システムを構築することを目的としている。昨年度、DT40細胞株において抗体遺伝子への突然変異と遺伝子変換の導入を厳密かつ任意に制御するために、突然変異と遺伝子変換に必須の因子であるAID遺伝子の発現をCre/loxPシステムを用いた遺伝子組み換えによって制御できる細胞株の育種を達成した。この細胞は、導入したCre-ERにより、4-hydroxytamoxyfen(4-OHT)添加時にloxPで挟まれたAIDの発現をON/OFFする。AIDの発現はGFPの発現でモニターし、AID OFFの時はピューロマイシン耐性として選択できる。本年度、この細胞の変異能力とスイッチ能力について評価した。4-OHTで48時間処理後、48時間追加培養したところ、OFF細胞から平均20%のGFP陽性細胞が出現した。このGFP陽性をセルソーターによって一細胞ずつ分離してAID ON細胞として培養した。2ヶ月間の継続培養後、ほぼすべてがGFP陽性であり、AIDの発現が安定して維持されていることが明らかになった。また、抗体軽鎖遺伝子上に蓄積された変異を解析したところ、解析した24クローン中13クローンで変異が認められ、DT40が本来有している能力に相当するあるいはそれ以上の変異能力を有していた。さらに、ON細胞を4-OHT処理したところ、平均50%のGFP陰性細胞が出現し、ピューロマイシン添加によりOFF細胞のみに純化できた。このOFF細胞から、再度の4-OHT処理でON細胞が出現し、ON細胞の単離、培養、OFF細胞へのスイッチが繰り返し可能であった。すなわち、この細胞を用いて、有用な変異体を取得後、AID OFFにより変異を固定し、再度ONにして抗体遺伝子に二次的変異を導入して改良することが可能になった。

本研究旨在利用DT40细胞修饰抗体基因的能力，构建抗体的分子进化系统。去年，为了严格、任意地控制DT40细胞系中抗体基因引入突变和基因转换，我们使用Cre/loxP系统表达了AID基因，这是突变和基因转换的必需因素。我们实现了可以通过基因重组控制的细胞系的育种。在这些细胞中，当添加 4-羟基三苯氧芬 (4-OHT) 时，引入的 Cre-ER 会打开/关闭夹在 loxP 之间的 AID 的表达。通过GFP的表达来监测AID的表达，当AID关闭时，可以选择嘌呤霉素抗性。今年，我们评估了这些细胞的突变和转换能力。用4-OHT处理48小时并额外培养48小时后，OFF细胞中平均出现20%的GFP阳性细胞。使用细胞分选仪将这些 GFP 阳性细胞逐个分离，并培养为 AID ON 细胞。连续培养2个月后，几乎所有细胞均呈GFP阳性，表明AID表达稳定维持。另外，当我们分析抗体轻链基因上积累的突变时，我们发现24个克隆中有13个克隆发生了突变，这表明它们具有与DT40原本具有的突变能力相当或超过的能力。此外，当ON细胞用4-OHT处理时，平均出现50% GFP阴性细胞，通过添加嘌呤霉素可以将其纯化为仅OFF细胞。通过重复4-OHT处理，从这些OFF细胞中出现ON细胞，并且可以重复分离、培养和将ON细胞转变为OFF细胞。换句话说，在使用这些细胞获得有用的突变体后，可以通过关闭AID然后再次打开它来修复突变，从而将二次突变引入抗体基因并改进它。