MMP-12トランスジェニックウサギを用いた動脈硬化発生機序の解析

MMP-12转基因兔分析动脉粥样硬化发生机制

• 批准号: 14770069
• 负责人: 卯木 浩之
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Chiba University (2003)University of Tsukuba (2002)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14770069/
• 关键词: トランスジェニックウサギ; MMP-12; 動脈硬化; 大動脈瘤; マクロファージ; 病態動物モデル; リュウマチ関節炎; 肺気腫

マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)は金属依存性の細胞外マトリックス分解酵素であり、動脈硬化や癌転移などに重要な役割を果たしていると考えられている。本研究ではエラスターゼ活性を持つマクロファージメタロエラスターゼ(MMP-12)の役割に注目し、動脈硬化やリウマチ関節炎、肺気腫などの炎症疾患の発生におけるMMP-12の役割をin vivoで解明することを目的として、ヒトMMP-12を過剰発現するトランスジェニック(Tg)ウサギモデルを開発し動脈硬化発生における泡沫細胞の形成、炎症性肉芽腫の形成、関節炎の発生におけるMMP-12の役割を検討した。マクロファージ(Mφ)特異的にMMP-12を過剰発現するTgウサギ作成のため、Mφスカベンジャー受容体プロモーターを有するMMP-12 cDNA発現ベクターを構築し、マイクロインジェクション法により遺伝子を導入した。移植した280個の受精卵より22羽の仔ウサギが産まれ、そのうち2羽にヒトMMP-12遺伝子が導入されていた。ヒトMMP-12 mRNAがTgウサギのMφで特異的に過剰発現していることをRT-PCR法により確認した。Mφ由来ヒトMMP-12蛋白の分泌を確認するために、ウサギの肺胞Mφ並びに腹腔内Mφを無血清培地で24時間培養して培養上清を調製した。これらの培養上清を10%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動後、抗ヒトMMP-12抗体でウェスタンブロットしたところ、TgウサギのMφからヒトMMP-12蛋白が分泌されていることが判明した。また、ザイモグラフィーによりMφから分泌されたヒトMMP-12蛋白はβ-カゼインならびにエラスチンを分解することが確認され、酵素活性を持つことが判明した。一方、Tgウサギでは正常ウサギに比べ炎症性肉芽腫や関節炎におけるMMP-12の発現が強く、Mφの浸潤が高度であることが病理学的解析により明らかとなった。動脈硬化発生・進展に及ぼすMMP-12の影響に関しては現在詳細に解析中である。本研究によりMφで特異的にMMP-12を過剰発現するTgウサギの開発に成功した。このウサギモデルは動脈硬化の発生病理の解明のみならず、炎症疾患の発生病理を解明する上で極めて有用な動物モデルになり得ると考えられる。

基质金属蛋白酶（MMP）是一种金属依赖性的细胞外基质降解酶，被认为在动脉硬化和癌症转移中起重要作用。 In this study, we focused on the role of macrophage metalloelastase (MMP-12) with elastase activity, and aimed to elucidate the role of MMP-12 in the development of inflammatory diseases such as arteriosclerosis, rheumatoid arthritis, and emphysema, in vivo, and developed a transgenic (Tg) rabbit model that overexpresses human MMP-12 and examined the role of MMP-12在泡沫细胞的形成中，在动脉粥样硬化，炎症性肉芽肿以及动脉硬化发展中。为了创建特异性在巨噬细胞（Mφ）中过表达MMP-12的TG兔子，构建了具有Mφ清除剂受体启动子的MMP-12 cDNA表达载体，并通过微注射引入该基因。 280个移植鸡蛋生了22只兔子，其中两个兔子被转移了人类MMP-12基因。 RT-PCR证实，在TG兔中，在Mφ下明确表达了人类MMP-12 mRNA。为了确认从Mφ的人MMP-12蛋白分泌，将兔肺泡Mφ和腹膜内Mφ培养在无血清培养基中24小时，以制备培养的上清液。将这些培养的​​上清液电泳在10％聚丙烯酰胺凝胶上电泳，然后用抗人MMP-12抗体蛋白质印迹，发现人MMP-12蛋白是从TG兔子的Mφ分泌的。此外，Zymography证实了从Mφ降解的β-蛋白和弹性蛋白分泌的人MMP-12蛋白，发现它具有酶活性。另一方面，病理分析表明，炎症性肉芽肿和关节炎中的MMP-12表达在TG兔中比正常兔子更强，Mφ侵袭更高。目前，MMP-12对动脉硬化的发展和发展的影响正在详细分析。这项研究成功地开发了一种特异性表达MMP-12的TG兔子。该兔子模型被认为是阐明动脉粥样硬化的病理以及阐明炎症性疾病病理学的极为有用的动物模型。

项目成果

Ishii T et al.: "Role of Nrf2 in the regulation of CD36 and stress protein expression in murine macrophages : activation by oxidatively modified LDL and 4-hydroxynonenal."Circulation Research. In press.

Ishii T 等人：“Nrf2 在调节小鼠巨噬细胞中 CD36 和应激蛋白表达中的作用：通过氧化修饰的 LDL 和 4-羟基壬烯醛进行激活。”循环研究。

Fan J et al.: "Lipoprotein(a) enhances advanced atherosclerosis in WHHL transgenic rabbits expressing human apolipoprotein(a)-A novel function of Lp(a) in vascular calcification"Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 22・Suppl. 20 (2002)

Fan J 等人：“脂蛋白 (a) 增强表达人载脂蛋白 (a) 的 WHHL 转基因兔中的晚期动脉粥样硬化 - Lp(a) 在血管钙化中的新功能”《动脉硬化、血栓形成和血管生物学》22·增刊 20。 (2002)

Sun H, Unoki H et al.: "Lipoprotein(a) enhances advanced atherosclerosis in WHHL transgenic rabbits expressing human apolipoprotein(a)"The Journal of Biological Chemistry. 277・49. 47486-47492 (2002)

Sun H、Unoki H 等：“脂蛋白（a）增强表达人载脂蛋白（a）的 WHHL 转基因兔子的晚期动脉粥样硬化”《生物化学杂志》277・49（2002）。