多局在性GAPDHの細胞内輸送機構と新規機能の解明

阐明多定位 GAPDH 的细胞内转运机制和新功能

基本信息

批准号：
14760085
负责人：
山地亮一
金额：
$ 1.66万
依托单位：
Osaka Prefecture University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)は細胞質において解糖系酵素群のひとつとして機能する以外に、膜や顆粒画分そして核においてエンドサイトーシス、小胞輸送、微小管重合、RNA輸送、DNA修復や複製、アポトーシス、神経変性疾患に関与する多機能タンパク質としても機能する。さらなる新規機能に関する情報を得るために、GAPDHと細胞内で相互作用するタンパク質を酵母Two-hybrid法により検索したところ、Ran結合タンパク質M(RanBPM)を候補タンパク質として見いだした。酵母in vivoアッセイ、大腸菌で作製した組換えタンパク質を用いたin vitroアッセイ、さらに細胞内で組換え体タンパク質を発現させたin vivoアッセイにより、RanBPMとGAPDHが細胞内で結合することを証明した。RanBPMはアンドロゲン受容体(AR)の転写活性を促進し、GAPDHはARと結合することが報告されているので、ARの転写活性に及ぼすGAPDHの効果を検討した。GAPDHはARの転写活性を促進し、その転写活性はRanBPMの存在下で相乗的に促進することが判明した。現在これらのタンパク質間での結合領域を同定している。さらにGAPDHの新規局在として細胞外におけるGAPDHの存在を検討し、GAPDHを培養細胞の培養上澄やラットの血清中で検出した。培地中にGAPDHを添加したCOS7細胞、HepG2細胞、HEK293細胞はディッシュ一面に広がらず、細胞塊を形成したが、細胞増殖速度に影響がなかったことから、細胞外GAPDHは、細胞の伸展を抑制することが判明した。この抑制はGAPDHの細胞膜表面への結合を介して起こっており、解糖系酵素としての活性中心である151番目のシステインをセリンに変異させた変異体は細胞膜表面に結合せず、また細胞の伸展を抑制しなかった。これらの結果より、151番目のシステインは細胞外GAPDHによる細胞伸展抑制に重要な役割を持つことが判明した。総括すると本研究により、GAPDHを新たなる局在と2つの異なる新規機能を証明した。

除了甘醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）之外，它还可以作为细胞质中的基于阳性氢的酶之一。为了获得有关进一步新功能的信息，当通过酵母两杂化方法搜索GAPDH和细胞间蛋白时，发现RAN结合蛋白M（RANBPM）是候选蛋白。 RANBPM和GAPDH已通过酵母在体内测定中与细胞结合，使用由大肠杆菌制成的重组蛋白进行体外测定，以及在细胞中表达重组蛋白的体内测定。 RANBPM促进了雄激素受体（AR）的转移活性，据报道GAPDH与AR结合，因此检查了GAPDH对AR转移活性的影响。 GAPDH促进了AR的转录活性，发现在RANBPM的存在下，转录活性是协同作用的。当前，确定了这些蛋白质质量之间的结合区域。此外，GAPDH被检查为GAPDH的新位置，在培养细胞和大鼠的培养物中检测到GAPDH。 COS7细胞，HEPG2细胞和HEK293细胞添加到培养基中的GAPDH并未扩散到整个菜肴中，并且形成了细胞质量，但不会影响细胞的增殖速度，因此外部GAPDH抑制了细胞的扩展。。这种抑制是通过与GAPDH的细胞膜表面结合而发生的，并且已被151次半胱氨酸突变的变体是活性的中心，该中心是丝酶，与丝网膜酶，不与细胞膜表面结合。和细胞。这些结果表明，第151个半胱氨酸在抑制GAPDH外部细胞抑制细胞延伸方面起着重要作用。总之，这项研究证明了GAPDH是两个不同位置的新功能。