脳毛細血管内皮細胞が発現する2つの型のエリスロポエチンレセプターの機能解明

阐明脑毛细血管内皮细胞表达的两种促红细胞生成素受体的功能

基本信息

批准号：
09760136
负责人：
山地亮一
金额：
$ 0.77万
依托单位：
Osaka Prefecture University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

エリスロポエチン(Epo)は、赤血球前駆細胞の増殖と分化に関与する糖タンパク質と考えられてきたが、申請者は、ラット及びマウス脳毛細血管内皮細胞が、正常型Epoレセプター(Epo-R)mRNA以外に択一的スプライシングによってイントロン5の挿入された異常型Epo-R(I5Epo-R)mRNAを発現していることを見い出した。本研究は異常型であるI5Epo-Rの機能を検討することを目的とした。ラット脳毛細血管内皮細胞から単離したI5Epo-RcDNAを解析したところ、イントロン5の挿入によって、終止コドンがエキソン7にフレームシフトしており、その翻訳産物が、細胞外ドメインと正常とは異なる71アミノ酸残基から成ると推測された。一方、既知のマウスI5Epo-Rは、イントロン5の配列内に終止コドンがあり、CHO細胞で発現させたとき、細胞外ドメインと正常とは異なる20残基のアミノ酸から成る可溶型レセプターとして細胞外に分泌されることが知られている。そこで、ラットI5Epo-R cDNAを用いて、その組換え体をCHO細胞で発現させた。Epo-RのN末端領域に対するペプチド抗体(Ab/Npeptide)を用いたウエスタンブロット解析は、ラットI5Epo-Rを発現しているクローンでは、培養上清画分ではなく、細胞抽出画分でポジティブなバンドを検出したが、マウスI5Epo-Rを発現するクローン(可溶型のポジティブコントロール)では、培養上清画分と細胞紬出画分の両方で、ポジティブなバンドを検出した。さらに、^<125>I-Epoを用いた結合実験から、マウスI5Epo-Rを発現しているクローンでは^<125>I-Epoの特異的な結合が観察され、また低親和性に分類されるKd=700pMのシングルクラスの結合部居が存在することが判明した。これらの結果から、I5Epo-Rはマウスでは可溶型として、ラットでは膜結合型として発現することが判明した。

促红细胞生成素（Epo）一直被认为是一种参与红细胞祖细胞增殖和分化的糖蛋白，但申请人发现大鼠和小鼠脑毛细血管内皮细胞含有除正常Epo受体（Epo-R）以外的mRNA。发现表达了异常的Epo-R（I5Epo-R）mRNA，其中通过选择性剪接插入了内含子5。本研究的目的是探讨异常型I5Epo-R的功能。对大鼠脑毛细血管内皮细胞分离的 I5Epo-R cDNA 进行分析发现，由于内含子 5 的插入，终止密码子移码至外显子 7，翻译产物与正常胞外结构域不同71，推测由氨基组成酸残留物。另一方面，已知的小鼠I5Epo-R在内含子5序列中有一个终止密码子，当在CHO细胞中表达时，它充当由胞外结构域和与正常不同的20个氨基酸残基组成的可溶性受体已知它是外部分泌的。因此，使用大鼠I5Epo-R cDNA，在CHO细胞中表达重组体。使用针对 Epo-R N 末端区域的肽抗体（Ab/N 肽）进行的蛋白质印迹分析表明，表达大鼠 I5Epo-R 的克隆在细胞提取物部分中显示出阳性结果，但在培养物上清液部分中没有显示阳性结果。在表达小鼠I5Epo-R的克隆(可溶性阳性对照)中，在培养物上清液级分和细胞提取级分中均检测到阳性条带。此外，根据使用^ 125 I-Epo的结合实验，在表达小鼠I5Epo-R的克隆中观察到^ 125 I-Epo的特异性结合，并且发现其被分类为低亲和力。类结合位点，Kd=700pM。这些结果表明，I5Epo-R在小鼠中以可溶形式表达，在大鼠中以膜结合形式表达。