ヒト臍帯血幹細胞を標的にした遺伝子導入および選択的増幅技術の基礎検討

人脐带血干细胞基因转移及选择性扩增技术基础研究

• 批准号: 14770533
• 负责人: 高徳 正昭
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Jichi Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14770533/
• 关键词: 遺伝子治療; 慢性肉芽腫症; 臍帯血細胞; 造血幹細胞; 幹細胞増幅

1.iBMTとSAGによる遺伝子治療技術慢性肉芽腫症などの遺伝性疾患に対し造血幹細胞遺伝子治療を臨床応用するためには、放射線照射や抗癌剤を使用する前処置はできる限り省くことが望まれる。そこで、前処置なしで造血幹細胞治療を可能にさせる基盤技術開発をカニクイザルの系で行った。まず、前処置なしで移植細胞を生着させる手段として骨髄内移植法(iBMT)をカニクイザルで検討した。まず、レトロウイルスベクターで標識遺伝子をCD34細胞に遺伝子導入し、この細胞をiBMTで前処置なしで移植した。移植後、コロニー形成細胞(CFU)全体の2-30%が遺伝子導入陽性細胞であったが、末梢血の遺伝子標識細胞は0.1%以下にとどまった。上記の問題を解決するために、移植後の遺伝子導入細胞を生体内で選択的増幅させる目的で選択的増幅遺伝子(SAG)を応用したシステムをiBMT系に組み合わせて検討した。これらの結果より前処置なしに生着した遺伝子導入細胞を、分子スイッチ(EPO)依存性に生体内で増幅させることに成功し、このレベルは臨床応用可能域にまで到達した。また、LAM-PCR法でクローナル解析を行い、増幅された細胞はポリクローン性増幅であることを確認した。2.臍帯血を標的にする検討ヒト臍帯血にSAG遺伝子をレトロウイルスベクターで遺伝子導入し、in vitroで増幅することは既に成功している。そこで現在これが生体内で可能かどうか、X-SCIDマウスに前処置なしでかつiBMT法で移植し、効果を解析しているところである。

1.利用iBMT和SAG的基因治疗技术为了将造血干细胞基因治疗应用于临床，例如慢性肉芽肿病等遗传性疾病，需要尽可能地消除使用放射线和抗癌药物的预处理。因此，我们开发了一种无需使用食蟹猴系统进行预处理即可进行造血干细胞治疗的基础技术。首先，我们在食蟹猴中研究了髓内移植（iBMT），作为一种无需预处理即可植入移植细胞的方法。首先，使用逆转录病毒载体将标记基因导入CD34细胞，并在不进行预处理的情况下用iBMT移植细胞。移植后，所有集落形成细胞（CFU）中有2-30%是基因转染阳性细胞，但外周血中基因标记细胞的数量仍低于0.1%。为了解决上述问题，我们将应用选择性扩增基因（SAG）的系统与iBMT系统相结合，在移植后体内选择性扩增转基因细胞。基于这些结果，我们成功地以分子开关（EPO）依赖的方式在体内扩增了无需预处理的移植基因转移细胞，并且该水平已达到可以临床应用的水平。另外，使用LAM-PCR方法进行克隆分析，证实扩增的细胞是多克隆的。 2.针对脐带血的考虑 利用逆转录病毒载体将SAG基因导入人脐带血并在体外进行扩增已经成功。因此，我们目前正在分析这是否可能在体内通过使用iBMT方法将其移植到X-SCID小鼠中而不进行预处理。

项目成果

Hanazono Y, Nagashi T, Takatoku M, et al.: "In vivo selective expansion of gene-modified hematopoietic cells in a nonhuman primate model"Gene Ther. 9. 1055-1064 (2002)

Hanazono Y、Nagashi T、Takatoku M 等人：“在非人类灵长类动物模型中体内选择性扩增基因修饰造血细胞”Gene Ther。

Itoh A, Okada T, Takatoku M, et al.: "A soluble CAR-SCF fusion protein improves adenoviral vector-mediated gene transfer to c-Kit-positive hematopoietic cells."J Gene Med. 5. 929-940 (2003)

Itoh A、Okada T、Takatoku M 等人：“可溶性 CAR-SCF 融合蛋白改善了腺病毒载体介导的基因向 c-Kit 阳性造血细胞的转移。”J Gene Med。