ヒト臍帯血幹細胞を標的にした遺伝子導入および選択的増幅技術の基礎検討

人脐带血干细胞基因转移及选择性扩增技术基础研究

• 批准号: 14770533
• 负责人: 高徳 正昭
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Jichi Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14770533/
• 关键词: 遺伝子治療; 慢性肉芽腫症; 臍帯血細胞; 造血幹細胞; 幹細胞増幅

1.iBMTとSAGによる遺伝子治療技術慢性肉芽腫症などの遺伝性疾患に対し造血幹細胞遺伝子治療を臨床応用するためには、放射線照射や抗癌剤を使用する前処置はできる限り省くことが望まれる。そこで、前処置なしで造血幹細胞治療を可能にさせる基盤技術開発をカニクイザルの系で行った。まず、前処置なしで移植細胞を生着させる手段として骨髄内移植法(iBMT)をカニクイザルで検討した。まず、レトロウイルスベクターで標識遺伝子をCD34細胞に遺伝子導入し、この細胞をiBMTで前処置なしで移植した。移植後、コロニー形成細胞(CFU)全体の2-30%が遺伝子導入陽性細胞であったが、末梢血の遺伝子標識細胞は0.1%以下にとどまった。上記の問題を解決するために、移植後の遺伝子導入細胞を生体内で選択的増幅させる目的で選択的増幅遺伝子(SAG)を応用したシステムをiBMT系に組み合わせて検討した。これらの結果より前処置なしに生着した遺伝子導入細胞を、分子スイッチ(EPO)依存性に生体内で増幅させることに成功し、このレベルは臨床応用可能域にまで到達した。また、LAM-PCR法でクローナル解析を行い、増幅された細胞はポリクローン性増幅であることを確認した。2.臍帯血を標的にする検討ヒト臍帯血にSAG遺伝子をレトロウイルスベクターで遺伝子導入し、in vitroで増幅することは既に成功している。そこで現在これが生体内で可能かどうか、X-SCIDマウスに前処置なしでかつiBMT法で移植し、効果を解析しているところである。

1。使用IBMT和SAG的基因治疗技术，以在临床上将造血干细胞基因治疗应用于诸如慢性肉芽肿的遗传疾病中，希望尽可能使用辐射和抗癌剂消除预处理。因此，我们开发了基本技术，可以在cynomolgus猴子系统中进行无需预处理的造血干细胞疗法。首先，在cynomolgus monkeys中研究了植物内移植（IBMT），以此作为未经预处理的移植细胞的一种手段。首先，将标记的基因转染为带有逆转录病毒载体的CD34细胞，并用IBMT移植而没有预处理。移植后，所有菌落形成细胞（CFU）中有2-30％是转基因阳性细胞，但外周血基因标记的细胞数量仍低于0.1％。为了解决上述问题，研究了使用选择性扩增基因（SAG）的系统与IBMT系统组合研究，以选择性地在体内放大移植细胞。这些结果成功地扩大了在分子开关（EPO）依赖性方式中刻有未经预处理的转基因细胞，达到了临床应用的范围。此外，通过LAM-PCR进行克隆分析，以确认放大细胞是多克隆扩增的。 2。靶向脐带血的研究已成功地转移到逆转录病毒载体并在体外扩增。因此，我们目前正在通过移植而没有预处理并使用IBMT方法来分析X-SCID小鼠的效果，并确定在体内是否可能。

项目成果

Hanazono Y, Nagashi T, Takatoku M, et al.: "In vivo selective expansion of gene-modified hematopoietic cells in a nonhuman primate model"Gene Ther. 9. 1055-1064 (2002)

Hanazono Y、Nagashi T、Takatoku M 等人：“在非人类灵长类动物模型中体内选择性扩增基因修饰造血细胞”Gene Ther。

Itoh A, Okada T, Takatoku M, et al.: "A soluble CAR-SCF fusion protein improves adenoviral vector-mediated gene transfer to c-Kit-positive hematopoietic cells."J Gene Med. 5. 929-940 (2003)

Itoh A、Okada T、Takatoku M 等人：“可溶性 CAR-SCF 融合蛋白改善了腺病毒载体介导的基因向 c-Kit 阳性造血细胞的转移。”J Gene Med。