糸状菌におけるジベレリン生合成酵素遺伝子クラスターの化学的解析

丝状真菌赤霉素生物合成酶基因簇的化学分析

基本信息

批准号：
13760089
负责人：
川出洋
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Tokyo University of Agriculture and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

Phaeosphaeria sp. L487株由来のジベレリン生合成酵素遺伝子クラスターから,生合成後期ステップに関与する20-oxidase (Ph20ox)をコードすると考えられる遺伝子の機能解析を進めた.ゲノムDNA上の配列からプライマーを設計し,RT-PCR,5'-RACE,3'-RACE等から完全長cDNA配列を決定した.完全長cDNA1761bpのうちタンパク質翻訳領域は1584bpで,膜結合型cytochrome P450モノオキシゲナーゼとして528アミノ酸残基をコードしていた.Ph20oxのアミノ酸配列は,イネ馬鹿苗病菌Gibberella fujikuroi由来の20-oxidaseと52%程度の相同性があった.異種タンパク質の形でPh20oxの酵素機能を調べるため,Ph20oxをメタノール資化性酵母用のベクター(pPICZ-B)に組み込み,メタノール資化性の高いPichia pastoris SMD1168株と資化性の低いP. pastoris KM71株を形質転換した.得られた形質転換体それぞれ1菌株ずつを用いて組変えタンパク質生産誘導とともにジベレリン基質・GA_<12>を添加して6日間培養を続けたところ,GA_<12>の代謝物としてGA_9 and/or GA_<25>をGC-MS分析により同定した.以上の結果より,カビ由来の20-oxidaseの酵素遺伝子の機能について異種タンパク質発現系を用いて初めて証明できた.現在,詳細な酵素反応解析ができるように,セルフリー系での実験の可能性を検討している.さらに,ジベレリン20-oxidaseがカビと植物とは全く異なる酵素種で関与していることに注日して,植物体内でカビ由来の膜結合型モノオキシゲナーゼタイプの20-oxidaseが成長制御に関与できるかどうかを調べるために,植物発現用コンストラクトを調製した.

我们从gibberellin biosynthetic酶基因簇中涉及的20-氧化酶（PH20OX）进行了对20-氧化酶（PH20OX）的功能分析。菌株L487。 Primers were designed from sequences on genomic DNA, and full-length cDNA sequences were determined from RT-PCR, 5'-RACE, 3'-RACE, etc. The protein translation region of the full-length cDNA1761bp was 1584bp, and it encoded 528 amino acid residues as membrane-bound cytochrome P450 monooxygenase. PH20OX的氨基酸序列是饭幼苗细菌Gibberella。来自藤本岛的20-氧化酶的同源性约为52％。为了以异源蛋白的形式研究PH20OX的酶功能，将PH20OX纳入了可甲醇辅助酵母（PPICZ-B）的载体中，并改变了具有高甲醇可及性特性的Pichia Pastoris smd1168，具有高甲醇的特性，并且具有低甲醇km71，具有低甲醇 - 甲醇 - 属于甲醇的物业。使用的每种转化体的一个菌株用于诱导重组蛋白的产生，并持续培养6天。 GA_9和/或用作GA__ <12>的代谢物。 GA_ <25>通过GC-MS分析确定。从上述结果中，只能使用异源蛋白表达系统证明霉菌衍生的20氧化酶的酶基因的功能。当前，我们正在研究无细胞系统中实验的可能性，因此可以进行详细的酶反应分析。此外，为了研究Gibberellin 20-氧化酶是否参与与霉菌和植物完全不同的酶种类，我们为植物表达准备了一种构造，以确定20-氧化酶（是否源自膜结合的单氧酶类型）是否可以参与植物中生长控制的霉菌。