ジベレリン生産糸状菌由来のカウレン合成酵素の構造と環化反応機構に関する研究

产赤霉素丝状真菌贝壳杉烯合酶的结构及环化反应机制研究

基本信息

批准号：
10760074
负责人：
川出洋
金额：
$ 1.15万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至 1999
项目状态：
已结题

项目摘要

(1)放射性標識コパリ二リン酸(CDP)の調製と精製を行った.市販されているトリチウム標識ゲラニルゲラニル二リン酸(GGDP)と大腸菌で作製した組換えCDP合成酵素(CPS)との反応からトリチウム標識CDPを合成した.粗抽出されたものを逆相系のイオンペアクロマトグラフィーにより精製し,基質として用いた.(2)Phaeosphaeria sp.L487株由来のカウレン合成酵素(FCPS/KS)の酵素反応を速度論的に解析し,これらを植物由来のCPSおよびカウレン合成酵素(KS)と比較した.FCPS/KSでは,CDPの親和性がGGDPよりも高く,KS活性の方がCPS活性よりも高かった.これは植物モデルとして用いたカボチャ由来のCPSおよびKSと似た傾向であった.しかしながら,植物のCPSでは高濃度のGGDPに対して基質阻害を示すのに対し,FCPS/KSではそのような阻害傾向は認められなかった.この違いは,植物におけるホルモン生合成とカビにおける二次代謝産物の生合成の制御機構の一つかもしれないと考えられた.(3)前年度に作製したFCPS/KSの各種組換え変異タンパク質(部位特異的変異体およびデリーション変異体)を精製し,それらの酵素活性を精密に調べた.FCPS/KSのアミノ末端側はCPS反応に関与し,カルボキシ末端側はKS反応に関与するが,精製タンパク質を用いて精査した結果,アミノ末端側はCPS反応だけでなくKS反応にも重要な影響を有するドメインであることが判明した.反応メカニズムが異なる植物のCPSおよびKS,あるいは他のジテルペン環化酵素でも,FCPS/KSのアミノ末端側と保存性の高い領域がある.多くのジテルペン環化酵素にみられるこの領域は,反応中の酵素を安定化させたり酵素-基質複合体になったときの安定化に重要な役割を持っているのかもしれない.(4)山形大学のグループによってcDNAクローニングされたGibberella fujikuroi由来のカウレン合成酵素cDNA(GfCPS/KS)を大腸菌体内で発現させ,組換え融合タンパク質を生産させた.このものの酵素活性は,Phaeosphaeria sp.L487株由来のFCPS/KSと同様,GGDPをCDPを経てカウレンに変換する多機能ジテルペン環化酵素であることを示した.

（1）放射性标记的二磷酸盐（CDP）的制备和纯化。 Tritium标记的CDP是根据在大肠杆菌中产生的市值的tritium标记的黄烷基烯丙基磷酸（GGDP）和重组CDP合酶（CPS）之间的反应合成的。通过反相离子对色谱法纯化提取的粗制，并用作底物。（2）Phaeosphaeria菌株Sp的Kaurene合酶（FCPS/KS）的酶反应。对L487进行了动力学分析，并将其与植物来源的CP和Kaurene合酶（KS）进行了比较。在FCPS/KS中，CDP的亲和力高于GGDP，KS活性高于CP。这与用作植物模型的南瓜衍生的CP和KS的趋势类似。然而，尽管植物CP显示出对高浓度GGDP的底物抑制作用，但在FCPS/KS中未观察到这种趋势。这种差异被认为是植物中激素生物合成的调节机制和霉菌代谢物生物合成的机制之一。（3）上一年产生的FCPS/KS的各种重组突变蛋白（位于位置的突变）。纯化身体和缺失突变体），并详细检查了其酶活性。 FCPS/KS的氨基末端侧参与了CPS反应，羧基末端侧参与了KS反应，但是纯化的蛋白质表明氨基末端侧是一个域，不仅对CPS反应，而且对KS反应具有重要作用。在具有不同反应机制的植物中的CP和KS中，有一些具有高度保守保护的区域以及FCPS/KS。该区域在许多二萜环化酶中发现，在反应过程中或变成酶 - 基底络合物时，可能在稳定酶中具有重要作用。（4）Yamagata大学小组克隆的Gibberella。来自藤库罗伊的Kaurene合酶cDNA（GFCPS/KS）在大肠杆菌细胞中表达以产生重组融合蛋白。该产品的酶活性被证明是一种多功能双萜环化酶，该酶通过CDP将GGDP转换为Kaurene，类似于Phaeosphaeria sp的FCPS/KS。 L487应变。