ジベレリン生産糸状菌由来のカウレン合成酵素の構造と環化反応機構に関する研究

产赤霉素丝状真菌贝壳杉烯合酶的结构及环化反应机制研究

基本信息

批准号：
10760074
负责人：
川出洋
金额：
$ 1.15万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至 1999
项目状态：
已结题

项目摘要

(1)放射性標識コパリ二リン酸(CDP)の調製と精製を行った.市販されているトリチウム標識ゲラニルゲラニル二リン酸(GGDP)と大腸菌で作製した組換えCDP合成酵素(CPS)との反応からトリチウム標識CDPを合成した.粗抽出されたものを逆相系のイオンペアクロマトグラフィーにより精製し,基質として用いた.(2)Phaeosphaeria sp.L487株由来のカウレン合成酵素(FCPS/KS)の酵素反応を速度論的に解析し,これらを植物由来のCPSおよびカウレン合成酵素(KS)と比較した.FCPS/KSでは,CDPの親和性がGGDPよりも高く,KS活性の方がCPS活性よりも高かった.これは植物モデルとして用いたカボチャ由来のCPSおよびKSと似た傾向であった.しかしながら,植物のCPSでは高濃度のGGDPに対して基質阻害を示すのに対し,FCPS/KSではそのような阻害傾向は認められなかった.この違いは,植物におけるホルモン生合成とカビにおける二次代謝産物の生合成の制御機構の一つかもしれないと考えられた.(3)前年度に作製したFCPS/KSの各種組換え変異タンパク質(部位特異的変異体およびデリーション変異体)を精製し,それらの酵素活性を精密に調べた.FCPS/KSのアミノ末端側はCPS反応に関与し,カルボキシ末端側はKS反応に関与するが,精製タンパク質を用いて精査した結果,アミノ末端側はCPS反応だけでなくKS反応にも重要な影響を有するドメインであることが判明した.反応メカニズムが異なる植物のCPSおよびKS,あるいは他のジテルペン環化酵素でも,FCPS/KSのアミノ末端側と保存性の高い領域がある.多くのジテルペン環化酵素にみられるこの領域は,反応中の酵素を安定化させたり酵素-基質複合体になったときの安定化に重要な役割を持っているのかもしれない.(4)山形大学のグループによってcDNAクローニングされたGibberella fujikuroi由来のカウレン合成酵素cDNA(GfCPS/KS)を大腸菌体内で発現させ,組換え融合タンパク質を生産させた.このものの酵素活性は,Phaeosphaeria sp.L487株由来のFCPS/KSと同様,GGDPをCDPを経てカウレンに変換する多機能ジテルペン環化酵素であることを示した.

(1)放射性标记的二磷酸柯巴(CDP)通过市售的氚标记香叶基香叶基二磷酸(GGDP)与大肠杆菌中产生的重组CDP合酶(CPS)反应来合成，并纯化粗提取物。通过反相离子对色谱法并用作底物 (2) Phaeosphaeria。我们对来自sp的贝壳杉烯合酶(FCPS/KS)的酶促反应进行了动力学分析，KS的活性高于GGDP，并且KS的活性高于CPS，这一趋势与CPS和CPS的活性相似。 KS源自南瓜，用作植物模型。然而，植物CPS对高浓度GGDP表现出底物抑制作用，而FCPS/KS则没有表现出这种抑制趋势，这种差异可能是由于植物中的激素生物合成和真菌中的二次抑制所致。人们认为这可能是对照之一。 (3) 各种重组突变蛋白（位点特异性诱变）。 FCPS/KS的氨基末端侧参与CPS反应，羧基末端侧参与KS反应。详细研究的结果发现，氨基末端侧是具有结构域的结构域。不仅对CPS反应而且对KS反应都有重要影响。 FCPS/KS 和其他二萜环化酶在 FCPS/KS 的氨基末端侧有一个高度保守的区域，该区域存在于许多二萜环化酶中，在反应过程中稳定酶可能具有重要作用。 (4) 赤霉属，其 cDNA 由山形大学的一个小组克隆。我们在大肠杆菌中表达了源自 E. fujikuroi 的贝壳杉烯合酶 cDNA (GfCPS/KS)，以产生重组融合蛋白。该蛋白的酶活性与源自 Phaeosphaeria sp. 的 FCPS/KS 相似。是一种多功能二萜环化酶，可将贝壳杉烯转化为贝壳杉烯。