腸管での抗原提示に関与するマウス小腸上皮細胞株の樹立

参与肠道抗原呈递的小鼠小肠上皮细胞系的建立

• 批准号: 13760095
• 负责人: 山田 潔
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13760095/
• 关键词: 小腸上皮細胞; 抗原提示; 腸管免疫; 小腸上皮内リンパ球; 細胞株; 初代培養細胞; 微生物由来物質; β-カテニン

本研究により、胎仔BALB/cマウスから小腸上皮細胞(IEC)を初代培養する方法を確立した。この方法は、EDTA溶液により処理を行った胎仔小腸組織片より増殖してくるIECを培養するもので、胎生15および16日目の胎仔小腸組織片からの上皮細胞の増殖が最も良好であった。次に、IECの増殖活性を亢進することが期待される活性化型β-カテニン遺伝子を、ヒト伸長因子1αサブユニットのプロモーター下流に挿入した発現ベクターを構築した。リポフェクション法およびエレクトポレーション法を用いて胎仔由来初代培養IECへの活性化型β-カテニン遺伝子の導入を試みたが、細胞増殖活性を維持したクローンの単離には至らず、細胞株を得ることは出来なかった。現在、SV40ウイルス由来のラージT抗原遺伝子の導入実験を行っている。一方、得られたマウス胎仔由来初代培養IECにおける免疫担当細胞としての特性についても解析を行った。培養開始2週間後、初代培養IECにおいて成熟マーカーと考えられるアルカリフォスファターゼ活性とMHCクラスII分子の発現が認められた。このMHCクラスII分子の発現は、培地中へのインターフェロンγの添加によって強く増強された。さらに、卵白アルブミン(OVA)特異的T細胞レセプターを発現するトランスジェニックマウスから精製した脾臓および小腸上皮内リンパ球由来CD4陽性T細胞に対し、抗原提示能を有することが明らかとなった。一方、初代培養IECの共存により、通常の脾臓CD4陽性T細胞の抗原特異的な増殖が抑制されることも示した。また、腸管免疫系に重要な影響を与えることが示唆されている微生物に対するIECの応答についても析を行った結果、初代培養IECが微生物由来物質を認識する受容体を発現していること、大腸菌およびリポ多糖に応答して、様々なサイトカイン遺伝子の発現が上昇することを明らかにした。

通过这项研究，我们建立了一种原代培养 BALB/c 小鼠胎儿小肠上皮细胞 (IEC) 的方法。该方法涉及培养从用 EDTA 溶液处理的胎儿小肠组织片中增殖的 IEC，并且在胚胎第 15 天和第 16 天时在来自胎儿小肠组织片的上皮细胞中发现最佳生长。接下来，构建了表达载体，其中将预期增强IEC增殖活性的活化的β-连环蛋白基因插入到人延伸因子1α亚基的启动子下游。我们尝试使用脂转染和电穿孔方法将活化的β-连环蛋白基因引入胎儿来源的原代培养的IEC中，但我们无法分离出保持细胞增殖活性的克隆，并且无法获得细胞系。我们目前正在进行实验，引入源自SV40病毒的大T抗原基因。另一方面，我们还分析了获得的小鼠胚胎来源的原代培养IEC作为免疫活性细胞的特征。培养开始两周后，在原代培养的 IEC 中观察到碱性磷酸酶活性和 MHC II 类分子（被认为是成熟标志物）的表达。通过向培养基中添加干扰素 γ，该 MHC II 类分子的表达得到强烈增强。此外，还发现它具有向来自表达卵清蛋白（OVA）特异性T细胞受体的转基因小鼠纯化的脾和小肠上皮内淋巴细胞的CD4阳性T细胞呈递抗原的能力。另一方面，我们还表明，原代培养的 IEC 的共存抑制了正常脾 CD4 阳性 T 细胞的抗原特异性增殖。我们还分析了IEC对被认为对肠道免疫系统具有重要影响的微生物的反应，发现原代培养的IEC表达了识别微生物来源物质的受体，并揭示了各种细胞因子基因的表达。脂多糖和脂多糖反应增加。

项目成果

村上 龍二: "Nucleotides enhance the secretion of interleukin 7 from primary-cultured murine intestinal epithelial cells"Cytotechnology. (印刷中).

Ryuji Murakami：“核苷酸增强原代培养的小鼠肠上皮细胞中白细胞介素 7 的分泌”细胞技术（正在出版）。

上野川修一: "食品とからだ 免疫・アレルギーのしくみ"朝倉書店. 216 (2003)

上野川秀一：“食物与身体：免疫和过敏的机制”朝仓书店216（2003）。