微生物を用いたα-置換カルボン酸のデラセミ化反応

利用微生物进行α-取代羧酸的去消旋反应

基本信息

批准号：
02J09958
负责人：
加藤太一郎
金额：
$ 1.92万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02J09958/
关键词：
生体触媒デラセミ化反応 α-置換カルボン酸酵素精製大腸菌による大量発現アシル-CoAシンセターゼアミノ基転移酵素立体反転反応光学活性体調整法反応機構解析破砕菌体反応基質特異性の検討代謝反応の抑制

项目摘要

生体触媒を用いたα-置換カルボン酸に対するデラセミ化反応についての研究を行った。デラセミ化反応とは基質化合物の構造を全く変化させることなく、単にラセミ体を光学活性体に変化させる反応のことである。つまり、ラセミ体を合成することが光学活性体を調製することとと同等の意味を持つ。昨年度までは放線菌の一種Nocardia diaphanozonaria JCM3208株を用い、本反応が脂肪酸の代謝経路であるβ-酸化経路との競合反応であること、本過程が複数の酵素が関与する複合反応機構であることを確認した。しかし、酵素の不安定性から酵素精製を行なうことは断念した。今年度は、α-メチルカルボン酸に対してデラセミ化活性を有する微生物を新たに探索した。その結果、菌体を破砕しても高いデラセミ化活性を保持している菌株Brevibacterium ketoglutamicum KU1073株を新たに見出した。本菌株を用いて酵素糖製を行なったところ、立体選択的にチオエステル化を触媒する酵素(ACS)を得ることができた。N-末端解析より、本酵素はバクテリア由来のMACSと高い相同性を有することを確認した。さらに遺伝子のクローニングを行い大腸菌による大量発現系を確立した。次にα-アミノ酸に対するデラセミ化反応についても検討を行った。D-フェニルアラニンを資化することを指標にスクリーニングを行い、複数の微生物を得ることに成功した。全菌体および破砕菌体を用いた検討から、本反応はケト酸を経由する反応であることを確認し、補因子要求性の検討から反応に関与する酵素を予想するに至った。検討に用いたSinorhizobium meliloti ATCC51124株は既に全塩基配列が明らかにされていたことから、アミノ基転位反応を触媒すると予想されるORFを大腸菌を用いて大量発現し、同時に大腸菌の有するD-アミノ酸デヒドロゲナーゼ(DadA)を培養条件を工夫することによって活性化することで、効率よくデラセミ反応を行なう組換え大腸菌を構築することに成功した。

对α-取代的羧酸的取代反应进行了生物催化研究。降解反应是一种反应，在该反应中，种族主义者简单地变为光学活性形式，而根本不改变底物化合物的结构。换句话说，种族的合成与准备光学活性产品的含义相同。直到去年，我们使用了一种放线菌的Nocardia dophanozonaria JCM3208，以确认该反应是与β-氧化途径的竞争反应，这是脂肪酸的代谢途径，并且该过程是一种复杂的反应机制，涉及多种酶。但是，由于酶的不稳定，我们已经放弃了酶纯化。今年，我们搜索了针对α-甲基羧酸的新微生物。结果，我们发现了新的Brevibacterium酮谷氨酸ku1073菌株，即使破坏细菌细胞，该菌株也会保留高降低活性。当使用该菌株产生酶时，获得了立体选择性硫酯催化催化性硫酯的酶（ACS）。 N末端分析证实，该酶与来自细菌的MAC具有很高的同源性。此外，将基因克隆来使用大肠杆菌建立大规模的表达系统。接下来，我们还研究了对α-氨基酸的脱粒化反应。使用D-苯基丙氨酸作为指标进行筛查，并成功获得多种微生物。从使用整体和破坏细菌的研究中，可以证实该反应是通过酮酸的，并且通过检查辅因子的需求，预测了参与反应的酶。已经揭示了研究中使用的Sinorhizobium Meliloti ATCC51124菌株的整个碱基序列，并且在很大程度上通过表达的ORF表达了预期的ORF，这些ORF可以使用E. coli催化氨基群的转置反应，它们能够激活D-氨基酸脱氢酶（DADA），通过培养培养物来激活D-氨基酸脱氢酶（DADA），这些反应是在培养的情况下进行的，这些反应是在培养中构建的，这些反应是在培养中构建的，这些反应是在培养的范围内构建的，这些反应是在培养中构建的，这些反应是在培养中构建的，该反应是在构建中的构造，这些反应是在培养中构建的。有效。