F_0F_1-ATP合成酵素のF_0モニターの1分子回転解析

F_0F_1-ATP合酶F_0监测器的单分子旋转分析

基本信息

批准号：
02J06699
负责人：
上野博史
金额：
$ 1.92万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02J06699/
关键词：
ATP合成酵素 1分子解析分子モーター分子モニター

项目摘要

本年度は、これまで最適化してきた酵素の分析条件を微小な金コロイドと高速度カメラを用いた高時間分解能の系に応用してH^+輸送の素過程と回転との関係を分析した。その結果、高時間分解能での酵素の回転観察に成功し、F_0F_1の回転の挙動の変化を詳細に解析することができ、これまで報告されていないその回転の性質がいくつか明らかになった。まず、ATP飽和条件でのF_0F_1の回転速度は、37℃で毎秒350回転にも達し、同じ条件で測定したF_1の回転速度(毎秒320回転)とほとんど変わりの無いものだった。この回転速度から見積もれば、F_0は毎秒3500個ものH^+を輸送することになる。さらに、回転速度のATP濃度依存性や、ATP結合やATP加水分解反応に関わる回転の挙動等はこれまでF_1単独で行われてきた実験の結果と大差ないことが示された。つまり、F_0F_1の回転の基本的な性質は、F_1と違いが無いことが明らかになった。このことから、F_0で起こるH^+輸送は律速にはならないこと、F_0での固定子/回転子間に存在する相互作用はほとんど無視できることがわかった。また、上記に述べたように通常の条件(F_0阻害剤なし)ではF_0の機能・構造に起因する回転の挙動の変化は観察されなかったが、F_0を特異的に阻害する阻害剤tributyltin chloride(TBT-Cl)存在下の回転観察では、F_0に起因する回転速度の低下が初めて観察された。TBT-Cl存在下では、F_0F_1の回転速度は非存在下に比べて約4%にも低下した。さらに詳細な回転の解析を行ったところ、TBT-Cl存在下での回転には、低濃度ATPでの回転で観察されたATP結合待ちや、加水分解反応の遅い基質であるATPγSでの回転で観察された加水分解待ちの時に見られた回転の長い休止は観察されなかった。この結果から、TBT-ClはF_0と相互作用した結果、F_1側のATP結合や加水分解反応を単純に遅くするわけではなく、複雑な阻害様式を示すことが本研究によって示された。

今年，我们将迄今为止优化的酶分析条件应用于使用小型金胶体和高速相机的高时间分辨率系统，分析了H^+传输和旋转的基本过程之间的关系。结果，我们成功地以高时间分辨率观察了酶的旋转，并能够详细分析 F_0F_1 旋转行为的变化，揭示了其旋转的几个先前未报道的特性。首先，F_0F_1在ATP饱和条件下的转速在37℃时达到了350转/秒，与相同条件下测得的F_1的转速（320转/秒）几乎相同。根据这个转速估计，F_0 每秒将传输多达 3500 H^+。此外，结果表明，旋转速度对 ATP 浓度的依赖性以及与 ATP 结合和 ATP 水解反应相关的旋转行为与单独使用 F_1 进行的实验结果没有显着差异。换句话说，很明显F_0F_1的旋转基本属性与F_1没有什么不同。这表明 F_0 处发生的 H^+ 传输不是速率限制的，并且 F_0 处定子和转子之间的相互作用几乎可以忽略。另外，如上所述，在正常条件下（无F_0抑制剂），没有观察到由于F_0的功能/结构而导致的旋转行为的变化，但是当使用抑制剂三丁基氯化锡（其特异性抑制F_0）时，在旋转观察中在 TBT-Cl 存在下），首次观察到 F_0 导致转速降低。当TBT-Cl存在时，F_0F_1的转速比不存在TBT-Cl时降低了约4%。更详细的旋转分析表明，在 TBT-Cl 存在的情况下，旋转涉及等待 ATP 结合，这在低浓度 ATP 的旋转中观察到，而与 ATPγS（一种缓慢水解反应的底物）的旋转则没有长时间的停顿。在等待水解时观察旋转。由此结果表明，TBT-Cl并不是通过与F_0相互作用而简单地减缓F_1侧的ATP结合和水解反应，而是表现出复杂的抑制模式。