ATP合成酵素のFoモーターの1分子回転観察-平面膜による膜電位の制御-

ATP合酶Fo马达的单分子旋转观察-平面膜对膜电位的控制-

基本信息

批准号：
06J08646
负责人：
上野博史
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2008
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06J08646/
关键词：
1分子計測分子モーター平面膜高速イメージング

项目摘要

本年度は、前年度に構築したエバネッセント照明による暗視野顕微鏡システム(以下、エバネッセント散乱法)の評価とこの手法を用いて回転分子モーターのサブミリ秒オーダーにわたる反応素過程の計測を行った。この手法との比較のために、対物レンズ内から垂直にサンプルを照明する手法(以下、垂直散乱法)を新たに構築して比較した。そのために、従来タイクロイックミラーを入れる場所に、中心に楕円のミラーコートがされた特殊なミラーを作製した。照明レーザー光はここで反射されて検出系とは反対側に垂直に照射されるので検出されない。一方、サンプルの散乱光はミラー部位以外の部分を通るので、背景光をカットした暗視野像が得られる。ガラスに固定した40nmの金コロイドを0.1ミリ秒の露光時間で、両手法により画像を取得したところ、エバネッセント散乱法は垂直散乱法と比べサンプル以外のバックグラウンド値が低く均一な画像が得られた。両者の画像のSN比を比べたところ、エバネッセント散乱法で得られた画像は垂直散乱法の画像と比べて約2倍のSN比を示した。さらに、金コロイドの重心の標準偏差からそれぞれの位置決定精度を測定したところ、両手法ともに約1〜2nmの位置決定精度を示した。さらに両手法は最高9.1マイクロ秒の露光時間においても約1〜2nmの位置決定精度を示した。マイクロ秒の時間分解能でナノメータの位置決定精度をもつこの手法はミリ秒以下のタンパク質のダイナミクスを計測するのに非常に有用であるといえる。さらにエバネッセント散乱法により、重水素置換が回転分子モーターであるF1のATP加水分解反応の素過程に与える影響を調べたところ、サブミリ秒単位の素過程の計測に成功し、重水素置換がATPのγリン酸の切断反応に影響を与えることを明らかにした。この結果から、F1のATP加水分解はプロトンの移動が律速であることが示唆された。

今年，我们对去年构建的渐逝照明暗场显微镜系统（以下简称渐逝散射法）进行了评估，并利用该方法测量了旋转分子马达的亚毫秒级反应基本过程。。为了与该方法进行比较，我们构建了一种从物镜内垂直照射样品的新方法（以下称为垂直散射法）并进行了比较。为此，我们制造了一种特殊的镜子，其中心有椭圆形镜涂层，代替传统的三色镜。照明激光束在这里被反射并垂直照射到与检测系统相反的一侧，因此不会被检测到。另一方面，由于样品的散射光穿过镜面部分以外的部分，因此可以获得背景光被切除的暗场图像。当使用固定在玻璃上的 40 nm 金胶体、曝光时间为 0.1 毫秒的两种方法获取图像时，与垂直散射方法相比，倏逝散射方法产生了除样品之外背景值更低的均匀图像。当比较两个图像的信噪比时，通过倏逝散射法获得的图像的信噪比大约是通过垂直散射法获得的图像的两倍。此外，当我们根据金胶体重心的标准差测量每种方法的定位精度时，两种方法的定位精度均约为1至2 nm。此外，即使曝光时间高达 9.1 微秒，这两种方法也显示出约 1-2 nm 的定位精度。该方法具有微秒级时间分辨率和纳米级定位精度，对于测量亚毫秒级蛋白质动力学非常有用。此外，我们利用倏逝散射研究了氘取代对旋转分子马达F1中ATP水解反应基本过程的影响，并成功地在亚毫秒尺度上测量了基本过程。它影响γ-磷酸的裂解反应。这一结果表明质子转移在 F1 的 ATP 水解中是限速的。