ATP合成酵素のFoモーターの1分子回転観察-平面膜による膜電位の制御-

ATP合酶Fo马达的单分子旋转观察-平面膜对膜电位的控制-

基本信息

批准号：
06J08646
负责人：
上野博史
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2008
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06J08646/
关键词：
1分子計測分子モーター平面膜高速イメージング

项目摘要

本年度は、前年度に構築したエバネッセント照明による暗視野顕微鏡システム(以下、エバネッセント散乱法)の評価とこの手法を用いて回転分子モーターのサブミリ秒オーダーにわたる反応素過程の計測を行った。この手法との比較のために、対物レンズ内から垂直にサンプルを照明する手法(以下、垂直散乱法)を新たに構築して比較した。そのために、従来タイクロイックミラーを入れる場所に、中心に楕円のミラーコートがされた特殊なミラーを作製した。照明レーザー光はここで反射されて検出系とは反対側に垂直に照射されるので検出されない。一方、サンプルの散乱光はミラー部位以外の部分を通るので、背景光をカットした暗視野像が得られる。ガラスに固定した40nmの金コロイドを0.1ミリ秒の露光時間で、両手法により画像を取得したところ、エバネッセント散乱法は垂直散乱法と比べサンプル以外のバックグラウンド値が低く均一な画像が得られた。両者の画像のSN比を比べたところ、エバネッセント散乱法で得られた画像は垂直散乱法の画像と比べて約2倍のSN比を示した。さらに、金コロイドの重心の標準偏差からそれぞれの位置決定精度を測定したところ、両手法ともに約1〜2nmの位置決定精度を示した。さらに両手法は最高9.1マイクロ秒の露光時間においても約1〜2nmの位置決定精度を示した。マイクロ秒の時間分解能でナノメータの位置決定精度をもつこの手法はミリ秒以下のタンパク質のダイナミクスを計測するのに非常に有用であるといえる。さらにエバネッセント散乱法により、重水素置換が回転分子モーターであるF1のATP加水分解反応の素過程に与える影響を調べたところ、サブミリ秒単位の素過程の計測に成功し、重水素置換がATPのγリン酸の切断反応に影響を与えることを明らかにした。この結果から、F1のATP加水分解はプロトンの移動が律速であることが示唆された。

今年，我们评估了上一年构建的黑场显微镜系统（以下称为evaneastent散射法），并在亚毫秒级的顺序上测量了旋转分子电机的反应物过程。为了与此技术进行比较，构建并比较了一种新的方法，从物镜内部垂直照亮样品（以下称为垂直散射方法）。因此，以前在放置了扎实镜子的中心涂有椭圆形的镜子。照明激光在这里反射，并在检测系统的另一侧垂直辐照，因此未检测到。另一方面，由于样品中的散射光经过镜面以外的部分，因此可以获得带有背景灯的深色场图像。当使用两种方法使用40 nm胶体金固定在玻璃上的情况下，曝光时间为0.1 ms时，与垂直散射方法相比，evaneScent散射方法的背景值低于样品。当比较图像的SN比率时，通过evanexcent散射方法获得的图像显示，通过垂直散射方法，SN比大约是图像的两倍。此外，当从金胶体的质心的标准偏差中测量定位精度时，两种方法的定位精度约为1-2 nm。此外，这两种方法均显示出大约1-2 nm的位置确定精度，即使在高达9.1微秒的暴露时间。该技术具有微秒的时间分辨率和纳米定位精度，对于测量毫秒下方的蛋白质动力学非常有用。此外，通过逃生的散射，我们研究了氘代替对F1的ATP水解反应的基本过程的影响，F1是一种旋转的分子运动，可以测量亚毫秒内的基本过程，揭示了氘代替会影响ATP ATP ATPγ-磷酸磷酸磷酸化的裂解反应。这些结果表明，F1的ATP水解是限制质子的质子转移。