DNA/タンパク質間相互作用の1分子多次元解析

DNA/蛋白质相互作用的单分子多维分析

基本信息

批准号：
18770145
负责人：
横田浩章
金额：
$ 2.37万
依托单位：
Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18770145/
关键词：
1分子計測超精密計測ナノバイオ分子モーター核酸

项目摘要

本研究では,蛍光1分子イメージングとDNA1分子力学測定技術を融合した顕微鏡の開発と,この顕微鏡を用いた多次元同時測定によるDNA複製・修復・組み換え時のDNAとDNA結合タンパク質1分子間のこれまで見ることができなかったダイナミックな相互作用の分子論的解明を目指している。(1)顕微鏡と計測解析プログラムの開発:効率よくチャンバー内の溶液が交換できるようなフローシステムを設計し,ガラス基板,両面テープの選定,PDMSによる設計を行った。また,1分子同時計測に必要なメカニカルな部分の駆動,磁気ビーズ像,蛍光1分子イメージングのための画像取得,DNAの力学変化に伴う磁気ビーズの3次元的な位置と1分子蛍光強度測定が行えるプログラムを開発した。(2)蛍光1分子イメージングのための大腸菌ヘリケースUvrDの蛍光標識:SH反応特異性が高いmaleimide基をもった蛍光色素で標識したヘリケースUvrDの蛍光標識サイト(Cys残基)を酵素消化・アミノ酸配列解析によって決定した。さらに,特定の単一のCys残基に70%程度の標識率でUvrDを活性を損なわずに蛍光標識することができた。(3)表面コーティング法の新規開発:現在1分子計測世界で標準的に行われているPEGコーティング法は,本研究に必要なだけのガラス表面上で十分なタンパク質の非特異吸着抑制能がない。そのため,プロトコールの改良を行い,タンパク質のみならず,半導体超微粒子(Qdot)のガラス表面上での非特異吸着抑制を抑制することができた。(4)1分子同時計測系の確立:磁気ピンセットで操作しているDNAに相互作用している蛍光色素,Qdot,蛍光ビーズで蛍光標識したヘリケースUvrDを1分子レベルで観察することに成功した。本研究に必要な同時計測系を確立できたことになる。

这项研究旨在开发一种显微镜，该显微镜结合了荧光单分子成像和DNA-1分子力学测量技术，并在DNA与DNA结合蛋白分子之间阐明了在DNA和DNA结合蛋白之间在DNA中进行了以前不见的动态相互作用，但使用此显微镜使用该显微镜进行了多维测量。（1）显微镜和测量分析程序的开发：设计流程系统旨在允许在腔室中有效交换溶液，并选择了玻璃基板，双面胶带，并使用PDMS进行设计。我们还制定了一个程序，该程序允许驱动一个分子，磁珠图像，荧光单分子成像的图像采集以及磁珠的3维位置以及由于DNA动态变化而导致的一个分子的荧光强度的三维位置所需的机械零件。（2）用于单分子成像的大肠旋转酶UVRD的荧光标记：荧光染料的荧光标记位点（Cys残基）用荧光染料携带具有高度特异性SH反应的荧光染料的荧光染料，这是通过酶促化剂挖掘和氨基酸序列分析确定的。此外，在特定的单个CYS残基上，UVRD可以用荧光标记约70％，而不会损害活性。（3）表面涂料方法的新开发：当前在单分子测量世界中标准的PEG涂层方法没有足够的能力来抑制本研究必要的蛋白质在玻璃表面上的非特异性吸附。因此，改进了该方案，以防止抑制非特异性吸附，不仅在蛋白质上，而且在超铁半导体颗粒（QDOT）的玻璃表面上。（4）建立同时测量系统：我们成功地观察到了螺旋病例UVRD荧光，并用荧光染料，QDOT和荧光珠与与单分子水平上的磁镊子相互作用的荧光珠相互作用。这意味着已经建立了本研究所需的同时测量系统。