DNA/タンパク質間相互作用の1分子多次元解析

DNA/蛋白质相互作用的单分子多维分析

基本信息

批准号：
18770145
负责人：
横田浩章
金额：
$ 2.37万
依托单位：
Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18770145/
关键词：
1分子計測超精密計測ナノバイオ分子モーター核酸

项目摘要

本研究では,蛍光1分子イメージングとDNA1分子力学測定技術を融合した顕微鏡の開発と,この顕微鏡を用いた多次元同時測定によるDNA複製・修復・組み換え時のDNAとDNA結合タンパク質1分子間のこれまで見ることができなかったダイナミックな相互作用の分子論的解明を目指している。(1)顕微鏡と計測解析プログラムの開発:効率よくチャンバー内の溶液が交換できるようなフローシステムを設計し,ガラス基板,両面テープの選定,PDMSによる設計を行った。また,1分子同時計測に必要なメカニカルな部分の駆動,磁気ビーズ像,蛍光1分子イメージングのための画像取得,DNAの力学変化に伴う磁気ビーズの3次元的な位置と1分子蛍光強度測定が行えるプログラムを開発した。(2)蛍光1分子イメージングのための大腸菌ヘリケースUvrDの蛍光標識:SH反応特異性が高いmaleimide基をもった蛍光色素で標識したヘリケースUvrDの蛍光標識サイト(Cys残基)を酵素消化・アミノ酸配列解析によって決定した。さらに,特定の単一のCys残基に70%程度の標識率でUvrDを活性を損なわずに蛍光標識することができた。(3)表面コーティング法の新規開発:現在1分子計測世界で標準的に行われているPEGコーティング法は,本研究に必要なだけのガラス表面上で十分なタンパク質の非特異吸着抑制能がない。そのため,プロトコールの改良を行い,タンパク質のみならず,半導体超微粒子(Qdot)のガラス表面上での非特異吸着抑制を抑制することができた。(4)1分子同時計測系の確立:磁気ピンセットで操作しているDNAに相互作用している蛍光色素,Qdot,蛍光ビーズで蛍光標識したヘリケースUvrDを1分子レベルで観察することに成功した。本研究に必要な同時計測系を確立できたことになる。

在这项研究中，显微镜的发展，该显微镜在DNA重复 /重新组合DNA重复 /重新组合时，融合荧光分子成像和DNA1分子机械测量技术以及DNA和DNA结合蛋白的DNA和DNA结合蛋白的DNA和DNA结合蛋白使用此显微镜的测量，我们旨在阐明无法看到的动态相互作用。（1）显微镜和测量分析程序的开发：一个可以有效替换腔室中解决方案的流系统，选定的玻璃基板，双层胶带和由PDM设计的。此外，1分子分子时钟测量所需的机械零件的驱动器，磁珠雕像，荧光珠1-分子成像的图像，由于DNA和DNA的变化而导致的磁珠的3D位置1-分子荧光强度测量。（2）荧光1分子成像结肠的HERI病例UVRD荧光标志：SH反应特征性Heri案例UVRD荧光符号（Cys残基）酶消化 /氨基酸序列的荧光染料。此外，可能会出现荧光标志，而不会损害特定的单个Cys残基的活性，而符号约为70％。（3）表面涂料方法的新开发：当前在世界上进行的PEG涂层方法在本研究所需的玻璃表面上没有非特异性的吸附抑制。结果，协议得到了改善，并抑制了半导体超纤维颗粒（QDOT）以及蛋白质的非特异性吸附控制。（4）建立了1个分子时钟测量系统：荧光荧光带有荧光，荧光珠与荧光珠与磁镊子操作的DNA相互作用，以一个分子水平的观察成功地观察。这意味着已经建立了本研究所需的时钟测量系统。