ゲノム情報の維持伝達に多面的に機能するクランプとそのローダー系の解析

分析在维护和传输基因组信息方面具有多方面功能的夹具及其加载系统

基本信息

批准号：
02J03453
负责人：
塩見泰史
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kyushu University (2003)Nara Institute of Science and Technology (2002)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

私は、真核生物の細胞周期進行に伴う様々なイベントに共通する反応機構と考えられる、クランプ・クランプローダー系に着目し研究を行ってきた。これまでに、チェックポイント応答経路で要求されるRad9-Hus1-Rad1(Rad9-1-1)複合体とRad17-RFC複合体を再構築・精製し、その解析からこれらの複合体がチェックポイントで機能するクランプ・クランプローダーとしての特性を持つことを明らかにした。そこで次の解析対象として、DNA複製後の娘染色体接着機構に関与する因子(Chl12)に着目し、この機構でのクランプ・クランプローダー系の役割を明らかにすることを目的として、ヒトChl12-RFC複合体の再構築を行い、その解析を行った。Chl12はチェックポイント応答系のRad17と同様に、複製で機能するクランプローダー、RFCの4つの小さいサブユニット(RFCs2-5)と新規クランプローダー型複合体を形成することが示唆されてきた。そこで、昆虫細胞発現系を用いてヒトのChl12とRFCs2-5を共発現させ、クランプローダー型複合体、Chl12-RFCを再構築・精製した。電子顕微鏡解析では、この複合体がRFCと同様の分子構造を形成していることを明らかにした。また、RFCと同様に複製のクランプであるPCNAと特異的に結合するが、チェックポイント応答系のクランプ、Rad9-1-1複合体とは結合しないことがわかった。さらにChl12-RFCは、プライマー/鋳型構造特異的なDNA結合活性と、DNA、PCNAによって促進されるATPase活性を有することがわかった。そこで、環状型DNAに対するPCNAローディング反応の解析を行ったところ、Chl12-RFCはRFCと同等のATP加水分解依存的なローディング活性を示した。以上より、Chl12-RFCが第二のPCNAローダーとして機能することを明らかにした。

我一直专注于夹具cran prouders，这被认为是与本地生物细胞周期相关的各种事件共有的反应机制。到目前为止，在检查点响应途径中需要Rad9-Hus1-Rad1（Rad9-1-1）复合物和RAD17-RFC复合物已重建和纯化，这些复合物是分析中的检查点。功能正常的夹具cran promer。因此，作为下一个分析，目的是关注DNA重复后染色体键合的因素（CHL12），并阐明夹具Cran促销系统在该机制中的作用。进行了分析。 CHL12建议，像RAD17一样，它形成了氏族打印机，该打印机可作为重复的RFC（RFCS2-5）和新的氏族打印机型复合物。因此，在昆虫细胞表达系统中使用了人CHL12和RFCS2-5的CHL12和RFCS2-5，并且重建并纯化了昆虫细胞表达系统，并且氏族打印机型复合物CHL12-RFC。电子显微镜分析表明，该复合物形成类似于RFC的分子结构。它还与PCNA（如RFC）特别结合，但发现它不与检查点响应夹和Rad9-1-1复合物结合。此外，已经发现CHL12-RFC具有底漆/霉菌结构特异性DNA键活性和由DNA和PCNA促进的ATPase活性。因此，当将PCNA载荷反应分析到环型DNA时，CHL12-RFC显示出与RFC相同的ATP水解负载活性。从上面可以阐明CHL12-RFC充当第二个PCNA装载机。