振幅可変型水晶発振子を用いる複雑系タンパク質間相互作用の解明

使用可变振幅晶体振荡器阐明复杂的蛋白质-蛋白质相互作用

• 批准号: 16655066
• 负责人: 岡畑 恵雄
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Tokyo Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16655066/
• 关键词: DNAポリメラーゼ; タンパク質間相互作用; 水晶発振子マイクロバランス; クランプローダー; クランプ; 振幅変化; 水晶発振子; 振幅の変化; 分子認識; ユビキチン; 結合と解離; DNAポリメラーゼ; タンパク質間相互作用; 水晶発振子マイクロバランス; クランプローダー; クランプ; 振幅変化; 水晶発振子; 振幅の変化; 分子認識; ユビキチン; 結合と解離

申請者らはこれまでに、水晶発振子の振動数がその電極上に結合する質量に比例して減少する(-1Hz=0.62ng cm-2)ことを利用して、様々な生体分子間相互作用の定量的解析を行ってきた。これまでは、水晶発振子の電圧を一定にして物質の結合による振動数の減少を見てきたが、本研究では、発振させる電圧を変化させることにより振幅を変化させ、結合している物質の解離と結合を制御できることを利用して、細胞内の複雑系タンパク質の相互作用の解析を定量的に行うことを目的にして研究を行い、以下の成果を得た。DNAポリメラーゼはテンプレート鎖に沿ってDNAを伸長する酵素であるが、ポリメラーゼはDNA鎖に横から挟み込むように結合しているだけであるので、それ単独ではDNA鎖を長く伸長できない。生体ではクランプとクランプローダーといわれるタンパク質と複合体を作ることによりポリメラーゼをはずれにくくし、長いDNA鎖を伸長できるようにしていると考えられている。水晶発振子の表面にDNA鎖とポリメラーゼ複合体を固定化し、振動電圧を3Vから5Vに増加させることにより振幅を大きくした。このことにより、弱く相互作用していたクランプやクランプローダーがDNA鎖から離れ、振幅を下げると可逆的に再結合する現象が水晶発振子の振動数変化から観察できた。このことからDNAポリメラーゼ複合体の結合の強さを定量化する事ができ、タンパク質複合体の再構築の制御が水晶発振子の振幅からできることがわかった。

申请人先前已经对各种生物分子相互作用进行了定量分析，利用了晶体振荡器的频率与质量结合在其电极上的质量（-1Hz = 0.62ng cm-2）的事实。到目前为止，由于物质耦合与晶体振荡器上的恒定电压，我们已经看到振动频率下降。但是，在这项研究中，我们进行了研究，目的是对细胞内复杂蛋白的相互作用进行定量分析，利用了一个事实，即可以通过更改振荡电压来改变振荡的电压，从而使结合材料的解离和结合得到控制，并且获得了以下结果。 DNA聚合酶是沿模板链延伸DNA的酶，但是聚合酶仅结合DNA链侧向，因此它们无法自身延伸长时间的DNA链。据信，在活生物体中，具有称为夹具和夹具装载机的蛋白质的复合物，可以防止去除聚合酶，并且可以扩展长DNA链。将DNA链和聚合酶复合物固定在晶体振荡器的表面上，并通过增加3V到5V的振荡电压来增加振幅。这使我们能够观察到可逆重组的现象，当时弱相互作用的夹具和夹具装载机留下DNA链并降低了晶体振荡器的振幅变化的频率变化。这使我们能够量化DNA聚合酶复合物的结合强度，很明显，可以从晶体振荡器的振幅中控制蛋白质复合物的重建。