DNA配列特異的ミスマッチ認識能を有する人工マルチ亜鉛フィンガー蛋白質のデザイン

具有DNA序列特异性错配识别能力的人工多锌指蛋白的设计

基本信息

批准号：
02J02027
负责人：
野村渉
金额：
$ 1.92万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

研究計画に沿いぐ亜鉛フィンガー蛋白質のドメイン間をつなぐリンカー配列におけるDNA結合への寄与に関する研究を進めてきた。典型的な亜鉛フィンガー蛋白質ではアミノ酸配列TGEKPが高度に保存されている。いくつもの亜鉛フィンガードメインを含む天然のマルチ亜鉛フィンガー蛋白質においては、このTGEKPリンカーの保存度があまり高くない。従って、長鎖DNA配列の認識において重要となるマルチ亜鉛フィンガー蛋白質の創製においてTGEKPリンカーを用いることが有効な手段となりうるかを明らかにする必要がある。そこでTGEKPリンカーで各ドメインをつないだ15亜鉛フィンガー蛋白質を新規に作製しそのDNA結合を検討した。結果として、15亜鉛フィンガー蛋白質は15個すべてのフィンガーを用いてDNAの主溝にはまり込み約50塩基対の配列に結合することが明らかになった。このことは長鎖DNA認識を行う蛋白質の創製に有用な情報を提供すると考えられる。また、認識ドメインとリンカー配列の関係を明らかにするために通常3塩基を認識するフィンガードメインを2塩基のみ認識するタイプに変換した亜鉛フィンガー蛋白質をデザインし、そのDNA結合を検討した。亜鉛フィンガードメインの認識ヘリックスの-1番のアミノ酸をアラニンに置換した場合に2塩基による認識が可能であることが示された。この場合、隣接する亜鉛フィンガードメインの距離的関係を最適に保つためにリンカー配列の長さ、種類を検討する必要がある。典型的なTGEKPリンカーを伸長した場合を検討したが、結合親和性の低下がみられ、この場合においてはリンカー配列の伸長は有効な手段ではないことが示された。2塩基認識ドメインを含む亜鉛フィンガー蛋白質におけるリンカー配列が最適化されれば亜鉛フィンガーによるDNA認識パターンの拡張も期待され、今後の検討が必要であると考えられる。

根据研究计划，我们一直在研究连接锌指蛋白域的接头序列中对DNA结合的贡献。典型的锌指蛋白具有高度保守的氨基酸序列TGEKP。在包含多个锌指结构域的天然多量指蛋白中，TGEKP接头不是很保守。因此，有必要阐明使用TGEKP接头是否可以成为创建多手指蛋白的有效工具，这对于识别长链DNA序列很重要。因此，我们使用TGEKP接头新构建了15个连接到每个结构域的锌指蛋白，并研究了它们的DNA结合。结果，发现15个锌指蛋白使用所有15个手指适合DNA的主要凹槽，并与大约50个碱基对的序列结合。人们认为这为识别长链DNA的蛋白质的创建提供了有用的信息。此外，为了阐明识别域与接头序列之间的关系，设计了一种锌指蛋白，其中通常识别三个碱基的手指域被转换为仅识别两个碱基的类型，并研究了其DNA结合。已经表明，当锌指域识别螺旋的氨基酸-1被丙氨酸取代时，具有两个碱基的识别。在这种情况下，有必要考虑连接器序列的长度和类型，以维持相邻锌指域之间的最佳距离关系。检查了一个典型的TGEKP接头扩展，但是观察到结合亲和力，表明在这种情况下，接头序列的扩展不是有效的度量。如果优化了含有两种碱基识别域的锌指蛋白中的接头序列，则预计还可以通过锌指对DNA识别模式的扩展，并且必须进行未来的研究。