世界最長のマルチ亜鉛フィンガーの創製と新機能

创造世界最长多锌指及新功能

• 批准号: 16659028
• 负责人: 杉浦 幸雄
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Doshisha Women's College of Liberal Arts (2005)Kyoto University (2004)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16659028/
• 关键词: 亜鉛フィンガー; マルチフィンガー; DNA結合; 塩基配列特異性; リンカー配列; 遺伝子機能; タンパク質設計; モチーフ; 長鎖認識

亜鉛フィンガータンパク質によるDNA塩基認識の特徴は、1)亜鉛フィンガー当り3塩基の認識、2)非対称なDNA塩基配列の認識、そして3)直列につながったDNA塩基配列の認識である。この特徴は新しい亜鉛フィンガー、特にマルチ亜鉛フィンガーの分子設計に極めて魅力的なフレームワークを与えている。転写因子Sp1由来の3つの亜鉛フィンガーモチーフを1ユニットとして、5ユニットを良く保存されたリンカーアミノ酸(TGEKP)によって連結させ、15個の亜鉛フィンガーが直列に並んだ新規亜鉛フィンガータンパク質を遺伝子工学的に作製した。本新規マルチフィンガータンパク質のDNAに対する特異的ゲルシフト法やフットプリント法によって検討した結果、GCボックスDNAへは7.0nMの高い結合親和性を示し、また約50塩基対に及ぶ広いフットプリントを与えた。これは15個の亜鉛フィンガーがすべてDNAとのコンタクトに関与していることを示唆している。生体内には多数のマルチ亜鉛フィンガータンパク質が存在し、実際、本研究成果が公表された後、植物界から類似の15個の亜鉛フィンガーをもつタンパク質が単離・同定された。この15-亜鉛フィンガータンパク質は人工的に創製された亜鉛フィンガータンパク質の中で最高最長のものである。マルチ亜鉛フィンガータンパク質は長鎖DNAの認識に最適であり、今後、重要な転写反応における人工リプレッサーとしての利用が期待できる。

锌指蛋白识别DNA碱基的特点是：1）每个锌指识别3个碱基，2）识别不对称DNA碱基序列，3）识别串联连接的DNA碱基序列。这一特征为新锌指，尤其是多锌指的分子设计提供了极具吸引力的框架。通过将源自转录因子 Sp1 的 3 个锌指基序的 5 个单位与保守的连接氨基酸 (TGEKP) 连接起来，通过基因工程创建了一种具有 15 个锌指串联排列的新型锌指蛋白。使用特定的 DNA 凝胶位移和足迹方法检查新型多指蛋白，结果显示它与 GC 盒 DNA 具有 7.0 nM 的高结合亲和力以及大约 50 个碱基对的宽足迹。这表明所有 15 个锌指都参与了 DNA 的接触。生物体中存在许多多锌指蛋白，事实上，在这项研究结果发表后，从植物界中分离鉴定出了具有15个相似锌指的蛋白。这种 15 锌指蛋白是最长的人工锌指蛋白。多锌指蛋白是识别长DNA链的理想选择，并且有望在未来用作重要转录反应中的人工阻遏物。

项目成果

Creation and Characteristics of Unnatural CysHis_3-Type Zinc Finger Protein

非天然CysHis_3型锌指蛋白的构建及特性

• 发表时间: 2004
• 期刊: Biochem.Biophys.Res.Commun. 325・2
• 作者: Kusaba;M.;S.Misumi;N.Takamune;S.Shoji et al.;Tetsuya Oshikawa;Hideko Nagasawa;T.Hirata;M.Imanishi;S.Negi
• 通讯作者: S.Negi

Sequence-Selective and Hydrobytic Cleavage of DNA by Zinc Finger Mutants

锌指突变体对 DNA 的序列选择性和水解切割

• 发表时间: 2004
• 期刊: J.Am.Chem.Soc. 126・47
• 作者: S.Kunimoto;W.Murofushi;H.Kai;Y.Ishida;A.Uchiyama;T.Kobayashi;S.Kobayashi;H.Murofushi;K.Murofushi-Murakami;A.Nomura
• 通讯作者: A.Nomura

An artificial six-zinc finger peptide with polyarginine linker

具有聚精氨酸接头的人工六锌指肽

• 发表时间: 2005
• 期刊: Biochem.Biophys.Res.Commun. 333・1
• 作者: Kusaba;M.;S.Misumi;N.Takamune;S.Shoji et al.;Tetsuya Oshikawa;Hideko Nagasawa;T.Hirata;M.Imanishi
• 通讯作者: M.Imanishi

Effects of linking 15-zinc finger domains on DNA linding specificity

连接 15-锌指结构域对 DNA 结合特异性的影响

• 发表时间: 2005
• 期刊: Bioorg.Med.Chem.Lett. 15・9
• 作者: Kusaba;M.;S.Misumi;N.Takamune;S.Shoji et al.;Tetsuya Oshikawa;Hideko Nagasawa;T.Hirata
• 通讯作者: T.Hirata