亜鉛フィンガーモチーフによるDNA認識と遺伝子ターゲティング

锌指基序的 DNA 识别和基因靶向

• 批准号: 10145226
• 负责人: 杉浦 幸雄
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10145226/
• 关键词: 亜鉛フィンガー; DNA結合モチーフ; 遺伝子ターゲティング; 塩基認識; 転写制御; 人工蛋白質

亜鉛フィンガー型DNA結合モチーフは、その繰り返し構造ゆえに約3塩基ずつ認識するモジュールの連結体として見ることができ、このような特徴は亜鉛フィンガーモチーフの数を変化させることにより、任意の塩基数を認識させることが可能である。転写因子Sp1のCys_2-His_2型亜給フィンガニドメインを用いた18および27塩基加NA配列を認識する人工蛋白質の創製に始めて成功した。すなわち、Sp1の3個の亜鉛フィンガー領域を基本単位として、5アミノ酸残基のリンカーで連結させた新規蛋白質Sp1ZF6とSp1ZF9を遺伝子工学的に合成し、そのDNA結合様式ゲルシフト法、フットプリント法、メチル化干渉法などを用いて追究した。その結果、Sp1ZF6とSp1ZF9はほぼ同程度のDNA結合親和性を示した。また、GCボックスを3個連続して含むDNAフラグメントを用いて結合実験を行ったところ天然Sp1は互いに隣接しない位置に2公子結合するのに対し、Sp1ZF6とSp1ZF9はGCボックスの3'末端側の1ヶ所で1分子結合することが認められた。特に重要なことは、Sp1ZF6とSp1ZF9は、それぞれ連続した18および27塩基対配列に結合していることで、これは新規蛋白質が任意の長さの連続する非対称DNNA配列に選択的に結合できることを強く示唆している。このような亜鉛フィンガーによるDNA塩基認識を基礎にした新しい遺伝子制御分子の創製は、21世紀の遺伝子治療への貢献が期待される。

由于其重复结构，锌指DNA结合基序可以被视为每个识别大约3个碱基的模块的组合，并且这一特征使得它能够通过改变锌指基序的数量来识别任意数量的碱基。可能这样做。我们首次利用转录因子 Sp1 的 Cys_2-His_2 型亚指结构域成功创建了一种可识别 18 碱基和 27 碱基附加 NA 序列的人工蛋白。具体而言，我们以Sp1的三个锌指区为基本单位合成了新的蛋白质Sp1ZF6和Sp1ZF9，并通过基因工程将其与5个氨基酸残基的连接子连接起来，并通过凝胶位移法、足迹法和印迹法确定了它们的DNA结合模式。我们使用干涉测量等方法对此进行了研究。结果，Sp1ZF6和Sp1ZF9表现出大致相同程度的DNA结合亲和力。此外，使用包含三个连续GC盒的DNA片段的结合实验表明，天然Sp1在彼此不相邻的位置处结合到两个分子，而Sp1ZF6和Sp1ZF9在GC盒的3'端处结合到一个分子。观察到结合在一个位置。特别重要的是，Sp1ZF6 和 Sp1ZF9 分别结合连续的 18 和 27 个碱基对序列，这表明新型蛋白质可以选择性地结合任意长度的连续不对称 DNA 序列。基于锌指DNA碱基识别的新基因调控分子的创建有望为21世纪的基因治疗做出贡献。

项目成果

T.Kamiuchi: "Artificial Nine Zinc-Finger Peptide with 30 Base Pair Binding Sites" Biochemisrty. 37・19. 13827-13834 (1998)

T.Kamiuchi：“具有 30 个碱基对结合位点的人工九锌指肽”，生物化学 37・19（1998）。

今西 未来: "新規亜鉛フィンガータンパク質の創製" 化学. 53・7. 72-73 (1998)

今西未来：“新型锌指蛋白的创造”化学53・73（1998）。

M.Yokono: "Unique DNA Bindinh Mode of the N-Terminal Zinc Finger of Transcription Factor Sp1" Biochemisrty. 37・19. 6824-6832 (1998)

M. Yokono：“转录因子 Sp1 N 末端锌指的独特 DNA 结合模式”，生物化学 37・19（1998）。