Improvement of accuracy of cell cycle controlled genome editing and its extension of scope to base editing technology

提高细胞周期控制的基因组编辑的准确性及其扩展到碱基编辑技术的范围

基本信息

批准号：
22H02201
负责人：
野村渉
金额：
$ 11.15万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

本研究ではタンパク質分解より迅速な応答が得られる細胞内局在変化（細胞質⇔細胞核）を利用した細胞周期制御型ゲノム編集の基盤構築を第一の目的とし，細胞周期制御型システムをBEにも適用し，塩基置換型ゲノム編集でのDNAおよびRNAオフターゲット作用抑制の実現を第二の目的としている。2022年度は細胞周期に同期したanti-CRISPRの細胞内局在変化についての蛍光観察と細胞内局在変化によるCRISPR-Cas9活性制御効果の検討を進めた。細胞周期に依存した細胞内局在変化を示すドメインにanti-CRISPRであるAcrIIA4と蛍光タンパク質を融合させ，蛍光顕微鏡で細胞内局在変化を確認した。現在，局在変化の定量的な解析手法について検討を進めている。CRISPR-Cas9の活性制御効果についてはS/G2期に細胞質への局在変化を示した後も一部のanti-CRISPRが細胞核内に残存している可能性が確認されており，それに伴ってCRISPR-Cas9活性の抑制効果が持続していることが確認されている。細胞質への局在変化が起こると同時にCRISPR-Cas9活性が誘起するためには局在変化だけでなくタンパク質分解など他の手法と組み合わせる方法を検討する必要があると考えられ，現在検討を進めている。dCas9-VPRを利用した転写活性化手法による細胞内でのCRISPR-Cas9とanti-CRISPRの相互作用解析についてはレポーターとして利用するGFPの半減期を最適化することで細胞周期に応じた相互作用の変化を適切に検出できる系を構築することができた。2023年度から開始を予定していたBase Editorへの応用についても既に実験に着手しており，anti-CRISPRにCdt1あるいはGemininを融合したタンパク質と各種Base Editorを組み合わせて細胞内で発現することによって一塩基置換反応の結果への影響を解析している。

这项研究的主要目的是使用亚细胞定位变化（细胞质核核）为细胞周期调节的基因组编辑建立基础，该变化允许比蛋白水解更快地反应，第二个目的是应用细胞周期调节的系统，并实现通过基础基础基因组的抑制DNA和RNA的抑制作用。在2022财年，我们对抗危机的亚细胞定位与细胞周期的同步中的亚细胞定位变化进行了荧光观察，并研究了由于亚细胞定位的变化而控制CRISPR-CAS9活性的效果。将抗危机ACRIIA4和荧光蛋白融合到一个显示细胞周期依赖性细胞定位变化的结构域，并通过荧光显微镜证实了亚细胞定位的变化。目前，我们正在考虑用于局部变化的定量分析方法。关于CRISPR-CAS9的活性调节作用，已经证实，即使在S/G2阶段将其定位变化到细胞质后，某些抗CrispR仍可能保留在细胞核中，并且已经证实，CRISPR-Cas9活性的抑制作用均存在。为了同时触发细胞质的定位变化，人们认为不仅必须考虑定位变化，而且有必要与其他方法（例如蛋白水解）相结合的方法，因此我们目前正在进行研究。为了分析使用DCAS9-VPR转录激活方法在细胞中CRISPR-CAS9与抗Crispr之间的相互作用，我们能够通过优化GFP的半衰期来构建一个可以适当地检测到对细胞周期的相互作用变化的系统，该系统被用作记者。我们已经开始在计划始于2023年开始的基础编辑器上进行实验，并通过将蛋白质与抗Crispr与CDT1或Geminin融合的蛋白质与各种基础编辑器相结合，我们已经通过将它们与抗抗Crispr和各种基础编辑者融合的蛋白质结合了单碱基替代反应的结果。