中枢神経系におけるアトラクチン局在部位の同定

中枢神经系统中吸引素定位位点的鉴定

基本信息

批准号：
13780665
负责人：
庫本高志
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Kyoto University (2002)National Cancer Center Research Institute and Research Center for Innovative Oncology, National Cancer Center Hospital East (2001)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度までに、膜型アトラクチンのN末、中央部、C末をそれぞれ認識する抗ラットアトラクチン抗体を作製した。N末、中央部を認識する抗体は膜型、分泌型両者を、C末を認識する抗体は膜型のみを認識することを、組み換えアトラクチンを発現する細胞株を用いたウエスタンブロットにより確認した。今年度は、作製した抗アトラクチン抗体を用いたラット脳の免疫組織学的解析を行った。8週齢の雄WTCラットの脳をホルマリン固定後、切片を作製した。0.5%過ヨウ素酸により内因性ペルオキシダーゼを失活させた。3種類の抗アトラクチン抗体を1%ヤギ血清で、それぞれ、500倍、1000倍、2000倍、8000倍希釈し、一次抗体として用いた。抗ウサギIgG(VECTOR社)を二次抗体として用い、VECTASTAIN Elite ABC(VECTOR社)により染色した。中央部を認識する抗体(膜型アトラクチンの678番目から693番目のポリペプチドを抗原として得られた抗体)を用いたときのみに、抗体特異的な染色を観察した。従って、以後この抗体を用いてラット脳でアトラクチンを発現している細胞の種類、細胞内分布を光学顕微鏡で検討した。その結果、多くの神経細胞で陽性所見を観察した。小脳では、プルキンエ細胞、顆粒細胞、分子層の神経細胞(星細胞、かご細胞)に染色性を認めた。また、プルキンエ細胞の樹状突起や、大脳皮質の神経突起にも陽性所見を認めた。プルキンエ細胞や他の大型の神経細胞を対象にして、細胞内の染色性を観察した。これらの細胞では、細胞膜よりもむしろ細胞質にびまん性に陽性所見を認めた。一方、染色性は弱いものの、白質のオリゴデンドロサイトと思われるグリア細胞にも陽性所見を認めた。これらの結果から、アトラクチンは主に神経細胞に発現していることが示された。

到去年，我们已经创建了抗大鼠吸引素抗体，可以识别膜型吸引素的 N 末端、中心区域和 C 末端。使用表达重组吸引素的细胞系进行蛋白质印迹证实，识别N末端和中央区域的抗体识别膜型和分泌型，而识别C末端的抗体仅识别膜型。今年，我们使用我们创建的抗吸引素抗体对大鼠大脑进行了免疫组织学分析。将 8 周大的雄性 WTC 大鼠的大脑固定在福尔马林中，然后切片。内源性过氧化物酶用 0.5% 高碘酸灭活。将三种类型的抗吸引素抗体分别用1%山羊血清稀释500倍、1000倍、2000倍和8000倍，并用作一抗。使用抗兔 IgG (VECTOR) 作为二抗，并用 VECTASTAIN Elite ABC (VECTOR) 进行染色。仅当使用识别中心区域的抗体（使用膜吸引素第678位至第693位多肽作为抗原获得的抗体）时，观察到抗体特异性染色。因此，我们使用该抗体通过光学显微镜检查了大鼠大脑中表达吸引素的细胞类型及其细胞内分布。结果，在许多神经细胞中观察到了阳性结果。在小脑中，在浦肯野细胞、颗粒细胞和分子层神经元（星状细胞和笼状细胞）中观察到染色。在浦肯野细胞的树突和大脑皮层的神经突中也观察到了阳性结果。我们观察了浦肯野细胞和其他大神经细胞的细胞内染色特性。在这些细胞中，在细胞质而不是细胞膜中广泛观察到阳性结果。另一方面，虽然染色较弱，但在神经胶质细胞中也观察到了阳性结果，这些细胞被认为是白质中的少突胶质细胞。这些结果表明吸引素主要在神经细胞中表达。