発現クローニング法によるES細胞増殖因子の同定と分化機構への関与に関する研究

表达克隆方法鉴定ES细胞生长因子及其参与分化机制的研究

基本信息

批准号：
13780588
负责人：
佐藤充治
金额：
$ 1.34万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13780588/
关键词：
ES細胞転写因子 Oct-3 4 LIF Stat3 未分化状態

项目摘要

ES細胞は、多分化能をもったまま培養可能な唯一の幹細胞であり、再生医療や遺伝子治療への応用が期待されている。しかし、マウスにおいてはLIF(leukemia inhibitory factor)の培地中への添加により、ES細胞を未分化な状態に保ったまま培養することが可能であるが、ヒトをはじめ、他の動物種においては、その効果がみられず、ES細胞の樹立自体が非常に困難を極めている。また、LIF以外にもES細胞の未分化状態を維持することのできる因子が存在することがLIF欠損マウスの細胞を用いた実験から示されており、そのような因子を同定することは、今後の再生医療の実用化にも大きな貢献をするものと考えられる。現在、マウスES細胞を用いた実験から、LIFと、その下流のgp130-Stat3の経路、さらに転写因子Oct-3/4がES細胞の未分化状態の維持に重要な役割を担っていることが示されているが、Oct-3/4とLIFのシグナル伝達経路とがどのような関係にあるのかについては不明であり、また、Oct-3/4がES細胞内で機能するためには、共役する因子の存在が必要であることもわかっている。そこで我々は、Oct-3/4と共役する因子を同定することで、LIFのシグナル経路とOct-3/4とを関連付けるような細胞内シグナル伝達経路、あるいはES細胞の未分化状態の維持に必要な新規の経路を見出すことを目的とした。未分化細胞特異的に発現の見られるRex-1遺伝子のプロモーター領域にはOct-3/4が結合するが、そのすぐ近傍にRoxと名づけられた未知の因子が結合することがわかっている。この因子を等電点電気泳動と、SDS-PAGEとを組み合わせることによって蛋白精製により同定した。得られたペプチドの内部配列をLC-MASによって調べ、対応する遺伝子を同定した。現在この因子の発現をsiRNAを用いて抑制し、ES細胞の未分化状態にどのような影響がでるかについての検討を行っている。

ES细胞是唯一可以培养的干细胞，同时仍具有多能潜力，并有望应用于再生医学和基因治疗。但是，在小鼠中，可以通过将LIF（白血病抑制因子）添加到培养基中，而在人类和其他动物物种中，可以通过将LIF（白血病抑制因子）添加到未分化的状态时进行培养，但是看不到效果，因此很难建立ES细胞本身。此外，使用LIF缺陷小鼠使用的实验表明，除LIF以外的其他因素可以维持ES细胞的未分化状态，并且人们相信，识别此类因素将在未来有助于再生医学的实际应用。 Currently, experiments using mouse ES cells show that the pathway of LIF and its downstream gp130-Stat3, as well as the transcription factor Oct-3/4, play an important role in maintaining the undifferentiated state of ES cells, but it is unclear what the relationship between Oct-3/4 and the signaling pathway of LIF is, and it is also known that the presence of a conjugating factor is necessary for Oct-3/4 to function within ES cells.因此，我们旨在确定夫妇与Oct-3/4的夫妇，并发现细胞内信号通路，将LIF的信号途径与OCT-3/4连接起来，或者维持未分化的ES细胞状态所需的新途径。 OCT-3/4与REX-1基因的启动子区域结合，该基因在未分化的细胞中特别表达，但已经发现，一个名为ROX的未知因子与其直接附近结合。通过将等电聚焦与SDS-PAGE相结合，通过蛋白质纯化来鉴定该因子。通过LC-MAS检查所得肽的内部序列，以鉴定相应的基因。目前，使用siRNA抑制该因子的表达，并正在研究以确定其对ES细胞未分化状态的影响。