Oct-3/4による初期分化決定機構の解析

Oct-3/4分析早期分化决定机制

基本信息

批准号：
11154214
负责人：
丹羽仁史
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11154214/
关键词：
ES細胞転写因子 Oct-3 4

项目摘要

1.研究目的未分化細胞特異的に発現する転写因子Oct-3/4は、我々のES細胞を用いた解析から、ES細胞の未分化状態を維持するためにはその一定量の発現が維持されることが必要であり、発現量の減少は栄養外胚葉への、増加は原始内胚葉への分化を誘導することが明らかになった(Niwa H.et al,Nat.Genet.,in press)。そこで、本研究では、このOct-3/4による遺伝子発現調節機構およびそれによる未分化状態維持/分化運命決定機構の解明を目的とし、次の3点の解析を行った。(1)Oct-3/4による転写活性化機構の解析(2)Oct-3/4の発現量増加による原始内胚葉分化誘導機構の解析(3)Oct-3/4の発現量減少による栄養外胚葉分化誘導機構の解析2.研究成果(1)転写因子Oct-3/4と結合する因子を単離するために、EGFP-Oct-3/4融合蛋白の発現によって未分化状態を維持されたES細胞GOWT1を樹立した。(2)(1)で得られた細胞の可溶化物を坑GFP坑体を用いて免疫沈降し、沈降物をSDS-PAGE法で解析し、未分化状態特異的に共沈してくる3つのバンド(CO1-3)を同定した。(3)(2)で同定されたバンドを単離してN端部分アミノ酸配列解析法および質量分析法で解析したところ、CO-1,3は細胞骨格成分の蛋白で、アーチファクトと考えられたが、CO-2は未知の蛋白と考えられた。(4)染色体外発現ベクターを用いた強制発現と、テトラサイクリンによる発現調節系を用いて、転写因子Cdx-2の発現がES細胞の栄養外胚葉への分化を誘導することを見い出した。(5)ゲノム遺伝子の解析から、Cdx-2の発現がES細胞においてはOct-3/4によって抑制されていること、およびCdx-2が自己のプロモーターを活性化しうることをルシフェラーゼアッセイ法により明らかにした。

1.研究目标：我们使用ES细胞的分析表明，为了维持未分化的细胞特异性转录因子Oct-3/4，发现需要一定量的表达来维持ES细胞的未分化状态，并且表达水平的降低会诱导分化为Trophectivem ni ni ni ni ni ni ni ni ni ni ni。按）。因此，在这项研究中，我们分析了以下三个点，目的是通过OCT-3/4阐明基因表达调节的机制以及维持未分化状态/确定分化命运的机制。（1）通过OCT-3/4（2）分析转录激活的机制，分析通过增加Oct-3/4（3）分析诱导营养剂差异的机制来诱导原始内胚层分化的机制，从通过表达EGFP-OCT-3/4融合蛋白的表达，保持在其未分化状态。（2）使用抗GFP抗体对（1）中获得的细胞的裂解物进行免疫沉淀，并通过SDS-PAGE对沉淀物进行分析，以鉴定在未分化状态下专门重新沉淀的三个谱带（CO1-3）。当在（3）和（2）中鉴定出的频带使用N末端部分氨基酸序列分析和质谱法分析并分析时，CO-1和3是细胞骨架成分的蛋白质，被认为是伪影，而CO-2则被认为是不知名的蛋白质。（4）使用强制表达使用外染色体体表达载体和基于四环素的表达调节系统，我们发现转录因子CDX-2的表达诱导ES细胞分化为滋养剂。（5）对基因组基因的分析表明，CDX-2在ES细胞中抑制了CDX-2的表达，并且CDX-2可以通过荧光素酶测定来激活其自己的启动子。