Tollファミリー分子による病原体認識機構の解明とそれを応用した癌免疫療法の開発

阐明Toll家族分子的病原体识别机制以及利用其开发癌症免疫疗法

基本信息

批准号：
13214083
负责人：
三宅健介
金额：
$ 1.98万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13214083/
关键词：
RP105 MD-1 MD-2 Toll-like receptor LPS

项目摘要

グラム陰性菌の膜成分リポ多糖(LPS)を免疫細胞が認識する機構についての解析を進めた。LPSはToll-like Receptor4(TLR4)と我々が発見したTLR4会合分子MD-2による複合体TLR4/MD-2によって認識されることを我々は昨年報告した。本年はTLR4/MD-2のプロトタイプであり、我々が発見したRP105/MD-1複合体のLPS認識における役割をノックアウトマウスを用いて検討した。RP105ノックアウトマウスのB細胞は問題なく産生され、分化し、B細胞レセプター、CD40を介するシグナルには異常は認められなかったが、LPS刺激による増殖反応と抗体産生反応において低応答性を示した。低応答性のメカニズムを細胞株を用いて検討したところ、TLR4/MD-2とRPl05/MD-1が、B細胞におけるLPS認識において機能的に協力していることが明らかになった。TLR4は単独ではLPSを認識できず、MD-2が会合したTLR4/MD-2複合体になって初めてLPSを認識できる。MDタンパクはLPS認識に重要な役割を果たしている。このMDタンパクの機能解析を進め、以下の成果を得た。1.MDタンパクの役割を明らかにするために、昨年度のRP105ノックアウトマウスに続いてMD-1ノックアウトマウスを作成し、その解析を行った。またその解析のためにマウスMD-1に対するモノクローナル抗体も作製した。RPl05欠損B細胞はLPS低応答性を示すが、MD-1欠損B細胞も同様なLPS低応答性を示した。そこで、MD-1欠損B細胞の細胞表面でのRP105、MD-1の発現を調べてみると、MD1ばかりでなく、RP105の発現も検出できなかった。すなわち、MD-1がRPl05の細胞表面への発現に必須の分子である事が明らかになった。2.MD-2の機能解析としてlipid A誘導体を用いた実験を行った。Lipid IVaはLipid Aの誘導体であり、マウスにはアゴニストとして、ヒトにはアンタゴニストとして作用する。この種特異的な薬理作用がTLR4によって規定されるのか、MD-2によって規定されるのか検討するためにマウスTLR4/ヒトMD-2のキメラ複合体を発現する細胞株を確立し、LipidIVaに対する応答性を検討したところ、ヒトと同様にLipidIVaは拮抗剤として作用した。MD-1がRP105の発現に必須であることをノックアウトマウスを用いて示した。MD-2においても同様である可能性があり、MDタンパクはTLRの発現に重要な役割を果たしている可能性がある。さらにMDタンパクはTLR4によるLPS認識に必須の分子であることをLipid IVaを用いて示した。LipidIVaの結果はTLR4によるLPS認識の微妙な特異性がMD-2によって影響されることを示しており、TLR4のエンドトキシン認識にMD-2が直接関わっていることを示唆している。これらの結果は癌免疫療法のために免疫賦活剤を開発するうえで、TLRばかりでなくMDタンパクも標的分子となりうることを示唆している。

我们分析了免疫细胞识别脂多糖（LPS）（革兰氏阴性细菌的膜成分）的机制。去年，我们报道了LPS被复杂的TLR4/MD-2识别，该复合物由Toll样受体4（TLR4）和我们发现的TLR4相关分子MD-2组成。今年，我们使用基因敲除小鼠研究了 RP105/MD-1 复合物（我们发现的原型 TLR4/MD-2 复合物）在 LPS 识别中的作用。来自 RP105 敲除小鼠的 B 细胞的产生和分化没有问题，并且 B 细胞受体和 CD40 介导的信号没有观察到异常，但它们对 LPS 刺激的增殖和抗体产生的反应性较低。当我们使用细胞系研究低反应性的机制时，我们发现TLR4/MD-2和RP105/MD-1在B细胞中的LPS识别中功能性地协作。 TLR4不能单独识别LPS，只有与MD-2形成TLR4/MD-2复合物时才能识别LPS。 MD蛋白在LPS识别中发挥重要作用。我们对该MD蛋白进行了功能分析并获得了以下结果。 1.为了阐明MD蛋白的作用，我们继去年RP105敲除小鼠之后又制作了MD-1敲除小鼠并进行了分析。我们还生产了针对小鼠 MD-1 的单克隆抗体用于分析。 RP105缺陷型B细胞显示出低LPS反应性，并且MD-1缺陷型B细胞也显示出类似的低LPS反应性。当我们研究MD-1缺陷型B细胞表面RP105和MD-1的表达时，我们不仅检测不到MD1的表达，也检测不到RP105的表达。换句话说，揭示MD-1是RP105在细胞表面表达的必需分子。 2.我们利用脂质A衍生物进行实验来分析MD-2的功能。 Lipid IVa 是 Lipid A 的衍生物，在小鼠中充当激动剂，在人类中充当拮抗剂。为了检查这种物种特异性药理作用是否受 TLR4 或 MD-2 调节，我们建立了表达嵌合小鼠 TLR4/人 MD-2 复合物的细胞系，并对 LipidIVa 产生反应。当我们研究该药物的作用时，LipidIVa 起作用。作为拮抗剂，与人类相似。我们使用基因敲除小鼠证明 MD-1 对于 RP105 的表达至关重要。 MD-2 可能也是如此，MD 蛋白可能在 TLR 表达中发挥重要作用。此外，我们使用Lipid IVa证明MD蛋白是TLR4识别LPS的重要分子。 LipidIVa结果表明，TLR4对LPS识别的微妙特异性受到MD-2的影响，表明MD-2直接参与TLR4对内毒素的识别。这些结果表明，不仅 TLR，MD 蛋白也可以作为开发癌症免疫治疗免疫刺激剂的靶分子。