Arthromces ramosus peroxidaseの酸化反応機構の解明

枝节节过氧化物酶氧化反应机制的阐明

• 批准号: 01J10374
• 负责人: 野中 大輔
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01J10374/
• 关键词: ペルオキシダーゼ; ヘム; 過酸化水素; 酸化反応中間体; 過酸化水素の活性化; アルギニン残基; ヘムタンパク質; 大腸菌発現系; 巻き戻し; 担子菌; ヒトヨタケ

前年度までにArthromces ramosus peroxidase(ARP)の大腸菌による発現系を構築し、大腸菌によりARPのポリペプチドは封入体として生成されること、さらにin vitroでの巻き戻しについて検討を行った。しかしながら、ARPはその構造中に4つのジスルフィド結合を有することからグルタチオンを用いた巻き戻しを検討したところ、高pH側で巻き戻しの効率が上昇することが明らかとなったものの、同時に高pH条件ではARPそのものが不安定であるため、全体では1%程度の巻き戻し効率しか得られなかった。このため、今年度はメタノール資化性酵母pichia pastorisでの発現系の構築を試みた。ARP cDNAを導入した菌体外への発現シグナルを有するベクターを構築し、pichia pastorisへと導入した。培養24時間後にメタノールにて発現を誘導したところARP群が確認された。さらに、ARPの活性発現に必須であるヘムの前駆体であるアミノレブリン酸およびFe^<2+>の添加により、活性型タンパク質の発現が促進されることが明らかとなった。現在、過酸化水素との反応に重要であるとされているアルギニン残基変異体の解析を行うべく変異体の発現・解析を行っている。

去年，我们利用大肠杆菌构建了Arthromces ramosus过氧化物酶（ARP）表达系统，并研究了大肠杆菌以包涵体形式产生ARP多肽的事实，并研究了其体外解旋。然而，由于ARP的结构中有四个二硫键，当研究使用谷胱甘肽的解旋时，发现在高pH下解旋效率有所提高，但由于ARP本身不稳定，总体解旋效率仅为1%左右。因此，今年我们尝试在甲醇同化酵母毕赤酵母中构建表达系统。构建了含有 ARP cDNA 和胞外表达信号的载体，并将其引入毕赤酵母中。培养24小时后用甲醇诱导表达，确认ARP组。此外，还揭示了氨基乙酰丙酸和Fe 2+ 的添加促进了活性蛋白的表达，其中氨基乙酰丙酸和Fe 2+ 是对于ARP活性的表达所必需的血红素的前体。目前，我们正在表达和分析精氨酸残基的突变体，精氨酸残基被认为在与过氧化氢的反应中很重要。