天然基質の官能基の一部として誤認識される小分子を用いた酵素の誤作動と酵素反応制御

使用被错误识别为天然底物官能团一部分的小分子进行酶故障和酶反应控制

基本信息

批准号：
16J02846
负责人：
小野田浩宜
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2016
资助国家：
日本
起止时间：
2016-04-22 至 2019-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

多くの生体触媒は、特定の原料を効率的に目的の分子へ変換する為に、高い基質特性を示す。この高い基質特異性により、生体触媒の汎用的な応用が制限されていた。私は、過酸化水素を用いて長鎖脂肪酸を特異的に酸化するCYP152B1を、酢酸水溶液中で扱うだけで、長鎖脂肪酸とは構造の異なる非天然基質の酸化反応を触媒する「基質誤認識システム」を報告していた。本研究では、「汎用的な基質誤認識システム」の開発を目指した。2017年度までに、好熱性細菌Exiguobacterium sp. AT1bから発見されたCYP152N1の発現系、精製手法の確立と、結晶構造の解析に成功した。この酵素が、過酸化水素を等量的に用いて、1分間あたり1900回転の速さで長鎖脂肪酸のα-位を(S)-選択的に水酸化することを2017年度に報告した。CYP152N1は、脂肪酸特異的なペルオキシゲナーゼであるCYP152A1やCYP152B1と同様に、長鎖脂肪酸のカルボキシル基を認識するので、長鎖脂肪酸以外の基質を酸化することができない。私達は、CYP152B1の活性部位近傍にカルボキシル基を持つグルタミン酸を変異導入することで、A245E変異体が「グルタミン酸のカルボキシル基を長鎖脂肪酸のカルボキシル基と誤認識」し、長鎖脂肪酸以外の基質を酸化する事を2016年度に報告していた。2018年度は、活性部位にグルタミン酸を導入する手法の汎用性を確認するために、CYP152A1 A246E変異体とCYP152N1 A243E変異体を作成し、チオアニソールのスルホキシド化活性とスチレンのエポキシ化活性を評価した。いずれの変異体もスルホキシド化活性とエポキシ化活性を示した。特にCYP152N1 A243E変異体は、野生型の長鎖脂肪酸水酸化反応の触媒活性活性より効率的な、スルホキシド化反応の触媒活性を示した。

许多生物催化剂表现出较高的底物特性，以便将特定的来源有效地转化为感兴趣的分子。这种高底物特异性限制了生物催化剂的一般应用。我报道了一种“底物错误识别系统”，该系统通过简单地处理CYP152B1来催化与长链脂肪酸不同结构的非天然底物的氧化反应，该结构仅处理CYP152B1，该cyp152b1使用过氧化氢在水溶液溶液中特异性地氧化长链脂肪酸。这项研究旨在开发“通用的底物错误识别系统”。到2017财年，我们成功地建立了一种在嗜热细菌中发现的CYP152N1的表达系统和纯化方法。 AT1B，并成功分析了晶体结构。 2017年，这种酶选择性地羟基使用相等量的过氧化氢，以每分钟的1900旋转速率以每分钟的1900次转速为α位。像CYP152A1和CYP152B1一样，它们是脂肪酸特异性的过氧化酶，CYP152A1和CYP152B1，CYP152N1也识别长链脂肪酸的羧基，因此不能氧化除长链脂肪酸以外的其他底物。我们在2016年报道说，通过在CYP152B1的活性位点与羧基突变谷氨酸，A245E突变体“有意义地识别出谷氨酸的羧基是长链脂肪酸的羧基，“氧化脂肪酸除脂肪酸之外”。在2018年，为了确认将谷氨酸引入活性部位的方法的多功能性，我们创建了CYP152A1 A246E和CYP152N1 A243E突变体，以评估硫烷酸的硫氧化活性和苯乙烯的环氧化活性。两个突变体均表现出氧化和环氧化活性。特别是，CYP152N1 A243E突变体显示出磺氧化反应的催化活性，这比野生型长链长链脂肪酸羟基化反应的催化活性更有效。