小麦、ジャガイモ、人参からの紫外線損傷修復光回復遺伝子のクローニング

克隆小麦、马铃薯和胡萝卜的紫外线损伤修复光恢复基因

基本信息

批准号：
01F00345
负责人：
山本和生
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01F00345/
关键词：
紫外線損傷光回復遺伝子可視光線 GC content 吸収スペクトル FAD GST-fusion 抗血清

项目摘要

紫外線損傷の光回復に関わる遺伝子を、イネ、麦、大豆、ジャガイモ、人参などの有用植物からクローニングし、光回復遺伝子を操作する事で、将来紫外線耐性の植物を作る計画をたてている。先ず手始めに、イネ光回復遺伝子のクローニングを行い、遺伝子産物のin vitroでの解析を行った。イネ光回復遺伝子の場合、大腸菌で発現させると、大腸菌の光回復欠損を相補することができた。精製した酵素はin vitroでDNA上の紫外線損傷を可視光線照射に依存して修復することができた。cDNA全長1521塩基対の前1/3のGC contentは約75%で、のこり2/3の50%と顕著な違いを示した。また、in vivoでは2種類の転写産物のあることが明らかとなった。酵素の吸収スペクトルを調べたところ、380nmと450nmに吸収を持っていた。酵素を95℃で煮沸した上清の吸収スペクトルを調べたところ、380nmと450nmに吸収を持ち、市販のFADを同じ吸収特性を示した。従って、イネ光回復酵素にはFADが光吸収物質として結合していることが明らかとなった。次にこの経験をもとに、麦、大豆、ジャガイモ、人参などから光回復遺伝子のクローニングを試み、今のところ、大豆からcDNAをクローニングすることに成功している。大豆光回復酵素はイネのそれと70%以上の相同性を持っており、500アミノ酸が作る大豆蛋白質をGST-fusionの形で大腸菌で大量発現させ、タンパク質を精製したところ、大腸菌の光回復遺伝子欠損を相補し、in vitroで紫外線損傷を修復した。現在は、酵素学的特性を明らかにするとともに、酵素に対する抗血清を作成し、これを用いて、大豆そのものから酵素を精製することを計画している。

该公司计划克隆从有用植物（例如大米，小麦，大豆，土豆和胡萝卜）中涉及轻度恢复的基因，并操纵光恢复基因，以在将来创建抗紫外线的植物。首先，克隆水稻光吸附基因，并在体外分析基因产物。在水稻光吸附基因的情况下，大肠杆菌中的表达能够补充大肠杆菌中的光吸收缺陷。纯化的酶能够通过依靠可见光照射来在体外修复紫外线损伤。 cDNA总长度为1521个碱基对的1/3的GC含量约为75％，显示出与泥浆中2/3的50％的显着差异。还揭示了体内有两种类型的成绩单。当检查酶的吸收光谱时，它在380 nm和450 nm处具有吸收。当检查了在95°C下煮沸的上清液的吸收光谱时，它在380 nm和450 nm处被吸收，并显示出与市售时尚相同的吸收特性。因此，已经表明，作为光吸收物质，时尚与水稻光吸收酶结合。根据这种经验，他们试图从小麦，大豆，土豆，胡萝卜等中克服轻恢复基因，而目前他们已经成功地从大豆中克隆了cDNA。大豆光吸附酶与水稻具有70％以上的同源性，由500个氨基酸产生的大豆蛋白在大肠杆菌中以GST融合的形式大量表达，并纯化了蛋白质，并补充E. coli中的光吸收基因缺乏症，并在体外修复UV损伤。目前，该公司计划澄清其酶促性能，并针对酶创建抗血清，该酶用于从大豆本身净化酶。