レンサ球菌に対するオプソニン効果を有する免疫グロブリン融合タンパクの開発

开发具有调理作用的抗链球菌免疫球蛋白融合蛋白

基本信息

批准号：
12877290
负责人：
浜田茂幸
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

マウス脾細胞cDNAライブラリーよりPCR法を用いてマウスCD44遺伝子およびIgG1 Fcフラグメントをコードする遺伝子を増幅した.ヒトフィブロネクチンタイプIリピート部分をコードする遺伝子断片は、ヒト末梢血cDNAライブラリーより同様に増幅した.増幅した遺伝子断片は、塩基配列を確認した後に、IK分泌シグナルをN末端に付加することができるベクターpSecTagにクローニングし、CD44-Fc融合タンパクを哺乳細胞内で発現するベクターpSecTag-CD44FcおよびpSecTag-FibFcを作製した.これらのベクターをハムスター由来のCOS細胞に遺伝子導入を行い、培養上清2LからプロテインAアフィニティーカラムを用いて、組換えタンパクを精製した.得られた融合タンパクの収量はCD44-Fcで約600ugFib-Fcで約2mgであった.そこで、まず最初にこれらを用いて、A群レンサ球菌の上皮細胞に対する付着・侵入の阻害効果について検討を加えた.A群レンサ球菌の莢膜に対するレセプターであるCD44の融合タンパクでは、A群レンサ球菌の上皮細胞への付着・侵入に対してはほとんど効果が認められなかった.しかし、フィブロネクチンのタイプIリピートを組み込んだFib-Fcでは野生株の細胞への付着・侵入を約40%、莢膜欠失株では約80%阻害することが明らかとなった.そこで、Fib-Fcを用いてさらにヒト末梢血の多型核白血球のA群レンサ球菌に対する貪食能を検討したところ、Fib-Fcを添加した場合、コントロールに加えたマウスのIgG1と比較して貪食が約2倍に増加した.これらの結果は、A群レンサ球菌の細胞表面に存在するF1,Sfb1,SfbII,Fbp54,Fbaなどのフィブロネクチン結合タンパクは菌の細胞への付着・侵入に最も重要な役割を果たしており、これらの結合を阻害することにより効果的に菌の付着・侵入を阻害できることが明らかとされた.さらに、Fcとの融合タンパクによりオプソニン作用も増強されることが明らかとなった。

小鼠CD44基因和IgG1使用小鼠脾细胞cDNA库中的PCR方法扩增了编码FC片段的基因。编码人纤连蛋白I型重复部分的基因片段类似地从人的外周血cDNA文库中放大。确认碱基序列后，将放大的基因片段克隆到矢量psectag中，该矢量可以为N末端添加IK分泌信号，而矢量psectag-cd4444fc和psectag-fibf和psectag-fibf，在哺乳动物细胞中表达CD44-FC融合蛋白。 c准备了。将这些载体转移到仓鼠衍生的COS细胞中，并使用蛋白A亲和柱从2L培养上清液中纯化重组蛋白。对于CD44-FC，获得的融合蛋白的产量约为2 mg，约为600UGFIB-FC。因此，我们首先将其用于研究附着和进入A组链球菌上皮细胞的抑制作用。 CD44，A组链球菌胶囊胶囊的受体。 A组的融合蛋白对A组链球菌上皮细胞的附着和进入几乎没有影响。但是，发现含有纤连蛋白I型重复序列的Fib-FC抑制了对野生细胞的附着和进入的附着，并在胶囊缺失菌株中抑制了约80％。因此，当使用FIB-FC进一步研究人类外周血对A组链球菌的多态性核白细胞的吞噬作用，当添加FIB-FC时，加入了对照。与小鼠IgG1相比，吞噬作用增加了约两倍。这些结果表明，纤连蛋白结合蛋白（例如F1，SFB1，SFBII，FBP54和FBA）存在于A组链球菌的细胞表面上，它们在细胞对细胞的附着和进入细胞的附着和进入，并抑制这些结合的结果最重要的作用，并可以有效地抑制该细菌的附着和进入。此外，据揭示了具有FC的融合蛋白也可以增强调整化。