新規高分子量GTP総合蛋白質の細胞内局在の動態と細胞生理学的機能の解析

新型高分子量GTP合成蛋白的细胞内定位动力学和细胞生理功能分析

基本信息

批准号：
12877009
负责人：
久保義弘
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12877009/
关键词：
GTP結合蛋白質 cDNA dynamin 細胞内局在

项目摘要

我々は、先にマウス脳から新規の高分子量GTP結合蛋白質のcDNAを単離した。このcDNA(nLG)は、Dynamin等の高分子量G蛋白質に類似した明確なGTP結合ドメインをもつものの、それ以外の部分においては既知の蛋白質と相同性を有しない。今回、C末端に対する抗体を用いて、コードされる蛋白について解析し、以下の知見を得た。(1)マウス脳の蛋白を用いたwestern blotでは、予想される分子量(120kDa)より小さい100と90kDaの2本のバンドが観察された。(2)cDNAを導入していない293T細胞では蛋白の発現は観察されず、導入した細胞では、120,100と90kDaの3本のバンドがみられた。組織学的にはvesicle状の細胞内局在を示した。(3)2nd MetをAlaに変えた点変異体でも発現蛋白に差異はなかった。(4)N端にFLAG-tagを付加したクローンでは、120kDaの蛋白のみが発現し、vesicle状の細胞内局在は顕著に観察されなかった。以上より、この蛋白の合成過程でN端においてプロセシングが行われること、このプロセシングが特徴的な細胞内局在に寄与することが示唆された。さらに、nLGの生理機能解明の端緒を探るべく、酵母two-hybrid法によりnLGに結合する蛋白質の検索を試みた。その結果、マウス脳cDNAライブラリーより複数種の陽性クローンを単離した。その中にはESTのみで登録されている新規遺伝子以外に、GABA_A受容体αサブユニットの1サブタイプの細胞内ドメイン、並びに3量体G蛋白質シグナル伝達系の調節因子であるRGSの1サブタイプも含まれていた。

我们先前从小鼠脑中分离了一种新型的高分子量GTP结合蛋白cDNA。该cDNA（NLG）具有类似于高分子量G蛋白（例如dynamin）的独特GTP结合结构域，但与其他地方的已知蛋白质没有同源性。在本文中，使用针对C末端的抗体分析了编码蛋白，并获得了以下发现。（1）使用小鼠大脑中的蛋白质在蛋白质印迹中观察到两个带100和90 kDa的条带，小于预期的分子量（120 kDa）。（2）在尚未用cDNA转染的293T细胞中未观察到蛋白质表达，在转染的细胞中观察到了三个带120,100和90 kDa的条带。从组织学上讲，亚细胞定位以囊泡的形式显示。（3）即使在更改为ALA的点突变体中，表达的蛋白质也没有差异。（4）在添加到N末端的Flag-tag的克隆中，仅表达了120 kDa蛋白，并且没有观察到类似囊泡的亚细胞定位。从以上，已经提出，该蛋白质合成期间在N末端进行加工，并且这种加工有助于特征下细胞定位。此外，为了找到阐明NLG生理功能的开始，我们尝试使用酵母两杂化方法搜索与NLG结合的蛋白质。结果，从小鼠脑cDNA文库中分离出多个阳性克隆。除了仅在EST中注册的新基因外，这些基因还包括GABA_A受体α亚基的一个亚型的细胞内结构域，以及RGS的亚型，RGS（三聚体G蛋白信号系统的调节剂）。