ATP受容体チャネルP2Xの発現状況に依存する構造と機能の変化の解析

根据 ATP 受体通道 P2X 表达状态分析结构和功能变化

基本信息

批准号：
18022042
负责人：
久保義弘
金额：
$ 5.18万
依托单位：
National Institute for Physiological Sciences
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18022042/
关键词：
生理学神経科学生体分子蛋白質シグナル伝達

项目摘要

昨年度までに、ATP投与後の定常状態におけるP2X_2チャネル電流と膜電位との関係を定量的に解析し、膜電位依存的ゲートが存在すること、さらに、この活性化相が、細胞外ATP濃度に依存性を示すことを見いだした。明確な膜電位センサー領域は存在しないことから、そのゲート機構の由来として、「ATPの結合自体、もしくは、ATPが結合したATP結合部位の構造変化が、膜電位依存的である。」という可能性を想定し、以下の変異体解析により検証した。ATP結合部位の変異体K71A,K71R,R290A,R290Kでは、野生型でみられる、膜電位-コンダクタンス関係のATP濃度依存性、活性化時定数のATP濃度依存性が、共に減弱する傾向があったが、ATP感受性が激減していたため、解析できるATP濃度に限りがあり、明確な結論を導くことができなかった。そこで、さらに、ATP感受性の低下が激しくない2種の変異体K69RおよびK308Rについて詳細な解析を行った。K69R変異体は、野生型に比し35倍のEC_50値の増加を示した。その膜電位・コンダクタンス関係はATP濃度依存性を示したが、野生型と異なり活性化時定数はATP濃度依存性を示さなかった。K308R変異体のEC_50値の増加は8倍と緩徐であった。その膜電位-コンダクタンス関係、および活性化時定数は、野生型と異なりATP濃度依存性を示さなかった。以上の「ATP結合部位の環境を変えることにより膜電位感知機構が変化する」という実験結果から「(膜電位センサーの動き等ではなく)ATP結合にまつわる膜電位依存性が、P2X_2チャネルの膜電位依存的活性化の源である。」ということが示唆された。

直到去年，我们定量分析了ATP给药后的P2X_2通道电流与稳态中的膜电位之间的关系，并发现存在膜电位依赖性栅极，并且该激活相位取决于细胞外ATP浓度。由于没有明确的膜电位传感器区域，因此我们通过假设“ ATP本身的结合或ATP结合是膜电位依赖的ATP结合位点的结构变化来验证了栅极机理的起源。”在突变体K71A，K71R，R290A和R290K中，ATP结合位点，膜电位传导关系的ATP浓度依赖性以及激活时间常数的ATP浓度依赖性（在野生类型中都倾向于降低了ATP的浓度，因为ATP的浓度是有限的，因为这两种情况都在PASS中均具有限制，因为ATP的浓度是有限的。无法达到。因此，对两个突变体K69R和K308R进行了详细分析，这些突变体的敏感性不会显着降低。与野生型相比，K69R突变体的EC_50值增加了35倍。膜电位传导关系取决于ATP浓度，但与野生类型不同，激活时间常数不取决于ATP浓度。 K308R突变体中EC_50值的增加速度慢，以8倍。与野生型不同，它的膜电位传导关系和激活时间常数没有ATP浓度依赖性。上面的实验结果表明，“ ATP结合位点的环境变化改变了膜电位感测机制”表明“膜电位依赖性（不是膜电位传感器的运动等）是P2X_2通道的膜潜在依赖性激活的来源。”