膜電位-細胞長変換素子プレスチンの分子構築と動的構造変化の解析

膜电位-细胞长度转换元件prestin的分子构建及动态结构变化分析

基本信息

批准号：
20056031
负责人：
久保義弘
金额：
$ 5.5万
依托单位：
National Institute for Physiological Sciences
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20056031/
关键词：
生理学神経科学生体分子蛋白質シグナル伝達

项目摘要

本研究では、膜電位依存的に内耳有毛細胞の長さを変えるのに寄与しているモーター蛋白プレスチンの膜電位依存的な構造変化を、全反射照明下FRET法により解析した。まず、サブユニット間のC末端間のみならず、サブユニット内のNおよびC末端間、さらに、サブユニット間のNおよびC末端間においても、高K+液の還流による脱分極時にFRETが減少することを明らかにした。次に、より定量的な情報を得るために、膜電位をパッチクランプ法により厳密にコントロールしながら、同時にFRET変化を測定する実験を行った。プレスチンの構造変化が顕著に起こる膜電位レンジは、先行するnon-linear capacitanceの解析により予想されている。そこで、FRETの変化がどの膜電位レンジで大きくなるかを定量的に解析したところ、nodinear capacitanceとよく類似した膜電位依存性を示すことが明らかになった。この結果は、本研究で検出したFRETの変化が、プレスチンの構造変化を正しく捉えているものであることを強く支持する。さらに、本研究で確立した全反射照明下FRET法による構造変化の解析手法を、GABAB受容体にも適用し解析を行った。GABAB受容体は、GABABR1aと、GABABR2の異なる二つのサブユニットでなるヘテロ二量体である。各々の様々な部位に蛍光蛋白を付加したコンストラクトを作成して解析を行った結果、リガンド投与時に、二サブユニット間の相対的配置の非対称な変化が起きていること、各々のサブユニット内での構造変化はあまり顕著でないことが明らかになった。

在这项研究中，在整个反射照明下通过FRET方法分析了膜蛋白prestin的膜电位依赖性结构变化，这有助于内耳毛细胞长度的膜电位依赖性变化。首先，据揭示了由于较高的K+流体反流引起的去极化时的FRET减少，不仅在亚基之间的C末端，而且在亚基内的N和C端之间以及亚基之间的N和C末端之间的N和C端之间。接下来，为了获得更多的定量信息，进行了一个实验，以同时测量fret变化，同时严格控制膜夹的膜电位。通过对先前的非线性电容的分析，可以显着预测Prestin结构变化的膜电位范围。因此，对哪些膜电位范围变化的定量分析表明，它们表现出类似于肿瘤电容的膜电位依赖性。这些结果强烈支持本研究中检测到的FRET的变化正确捕获了Prestin的结构变化。此外，在本研究中建立的总反射照明下使用FRET方法进行结构变化的分析方法也应用于GABAB受体。 GABAB受体是由两个不同亚基的Gababr1a和gababr2组成的异二聚体。分析是通过创建构造中添加荧光蛋白的构建体中进行的，并揭示了两个亚基之间在配体给药时发生的相对构型的不对称变化，并且每个亚基内的结构变化并不是很明显。

项目成果

期刊论文数量（8）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

内耳外有毛細胞の膜電位-細胞長変換素子プレスチンの単粒子構造解析

内耳外毛细胞膜电位-细胞长度转换元件 prestin 的单颗粒结构分析

DOI：
发表时间：
2008
期刊：
影响因子：
0
作者：
久保義弘;三尾和弘;小椋利彦;山本友美;佐藤主税
通讯作者：
佐藤主税

Caffeine activates mouse TRPA1 channels but suppresses human TRPA1 channels

DOI：
10.1073/pnas.0809769105
发表时间：
2008-11-11
期刊：
PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA
影响因子：
11.1
作者：
Nagatomo, Katsuhiro;Kubol, Yoshihiro
通讯作者：
Kubol, Yoshihiro

Functional and structural identification of amino acid residues of the P2X2 receptor channel critical for the voltage- and [ATP]-dependent gating