ヒト細胞での遺伝子破壊系の開発とゲノム機能解析への応用

人类细胞基因破坏系统的开发及其在基因组功能分析中的应用

基本信息

批准号：
12206012
负责人：
安井明
金额：
--
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12206012/
关键词：
遺伝子組換え DNA修復遺伝子破壊トウスジュニックマウス

项目摘要

これまで、細胞やマウスでの実験系の確立を行った。高発現が相同組換えを昂進する可能性のある遺伝子として、相同組換えの開始に働くヒトRAD51とRAD52遺伝子、NBS1、MRE11、RAD50の三者複合体、組換えの際に飛び出たDNA端を切り取るERCC1、XPFの複合体などが考えられる。まず、データベースから得られたヒト由来のRAD51とRAD52遺伝子のcDNAの配列からプライマーを作成して、ヒトtestis由来のcDNAをPCRし、その後、配列を決定して変異の部分を修正し、データーベース通りのcDNAを得た。これを、高発現させる為に、ニワトリβアクチンのプロモーターを持つ発現ベクター(大阪大学・宮崎純一教授より供与)に導入した。同様に、NBS1とERCC1についてもこのベクターを用いて発現コンストラクトを作成した。このDNAを導入するヒト細胞株として、HeLa細胞とヌクレオチド除去修復欠損株であるXPAの細胞(XPA12-ROSV)を用いた。これまでに、ほぼ全ての形質転換株が得られ、発現の定量と、組換え頻度の解析を行っている。ゲノム上のDNA鎖切断は高頻度組換えを誘導することが知られている。我々の単離した、紫外線損傷の直ぐ5'に単鎖切断を入れるUVDE遺伝子を高発現したヒトXPA細胞を樹立し、単鎖切断の影響について詳しく解析した。これについても、組換え頻度への影響を解析している。マウス個体での組換え頻度の向上の為に、ヒトRAD51遺伝子のtransgenic mouseを作成した。ヒトRAD51は分子量の差からマウスのものと区別でき、マウスの各組織でマウスのRAD51以上の発現が見られた。正常に発育したが、時間と共に発癌と肥満の傾向が見られ、現在、統計的な有意差を測定中である。RAD52のtransgenic mouseについても計画中である。

到目前为止，已经在细胞和小鼠中建立了实验系统。高表达可以促进同源重组的基因包括发起同源重组的人类Rad51和Rad52基因，NBS1，MRE11和RAD50的三方复合物以及ERCC1，XPF复合物，在重组过程中切除了DNA末端的DNA。首先，从数据库中获得的人源性RAD51和RAD52基因的cDNA序列产生了引物，并确定了源自人睾丸的cDNA，并确定序列可修改突变部分，根据数据库导致cDNA。它被引入具有鸡β-肌动蛋白的启动子的表达载体（由大阪大学宫崎骏教授提供）。同样，使用该向量为NBS1和ERCC1创建了表达构建体。 HeLa细胞和XPA细胞（XPA12-ROSV）（一种核苷酸切除修复有缺陷株）用作人体细胞系来引入该DNA。迄今为止，几乎所有转化子都已获得，量化了它们的表达并分析重组的频率。已知基因组上的DNA链断裂会诱导高频重组。我们建立了高度表达UVDE基因的人XPA细胞，该基因在紫外线损伤后立即在5'中携带单链断裂，并详细分析了单链断裂的作用。这也对其对重组频率的影响进行了分析。为了提高小鼠个体重组的频率，创建了人Rad51基因的转基因小鼠。由于分子量的差异，可以将人RAD51与小鼠区分开，并且在小鼠的每个组织中观察到Rad51或更高的小鼠的表达。尽管它正常发展，但随着时间的流逝，已经观察到了癌症和肥胖症的趋势，目前正在测量统计学上的显着差异。 Rad52转基因小鼠也正在建设中。