部分ペプチドを用いた蛋白質・蛋白質相互作用の解析

使用部分肽分析蛋白质-蛋白质相互作用

基本信息

批准号：
12034206
负责人：
若松馨
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Gunma University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.レセプターによるG蛋白質を活性化にはα5ヘリックスとβ2/β3ループの間の塩橋が必須であることをGi1αについて示してきた。一方、報告されているGsαのX線結晶構造には塩橋が存在しないが、アミノ酸配列の保存性からそのX線結晶構造が間違っている可能性がある。塩橋をなくしたGsαのmutantはレセプターで活性化されなかったことから、塩橋はG蛋白質一般に必須であることが確認された。また、m4ムスカリンレセプターの部分ペプチドはm4レセプターと同様にGsを活性化せずGi1を強く活性化したことから、m4レセプターの良い低分子モデルとなる事が確認された。2.生体膜に結合した時のペプチド・蛋白質の構造を解析する時の膜のモデルとしてbicelleを光散乱及びNMRで検討した。CHAPSOはDHPCに比べて広い濃度・温度範囲で安定したbicelleを形成することがわかり、DMPC/CHAPSOとDLPC/CHAPSOについて流体力学半径を決定した。また、ペプチドを取り込んでも半径はほとんど変化しない事を確認した。bicelleに組み込んだMPX-Gは低温でも良好なHSQCスペクトルを与えたので、bicelleは膜蛋白質のNMRにも有効であると期待された。3.細菌の細胞膜に穴を開けることによって殺菌作用を示すマガイニン2は、脂質二重膜中に結合した時に2本のαヘリックスが逆平行になったダイマーを形成する事をTRNOEで既に決定している。この構造が正しい事を確認するために、構造を保持したままSS結合で架橋されたダイマー(SSダイマー)をデザイン・化学合成した。事実、SSダイマーはモノマーのマガイニン2と協同的に作用しモノマーの活性を高める事がわかった。

1.我们已经证明，对于 Gi1α，α5 螺旋和 β2/β3 环之间的盐桥对于受体激活 G 蛋白至关重要。另一方面，虽然报道的Gsα的X射线晶体结构中不存在盐桥，但由于氨基酸序列的保守性，X射线晶体结构可能不正确。缺乏盐桥的 Gsα 突变体不会被受体激活，这证实了盐桥对于一般的 G 蛋白来说是必需的。另外，m4毒蕈碱受体的部分肽强烈激活Gi1而不激活Gs，与m4受体类似，因此证实其是良好的m4受体小分子模型。 2. 使用光散射和 NMR 作为膜模型对 Bicelle 进行研究，用于分析与生物膜结合的肽和蛋白质的结构。结果发现，CHAPSO 在比 DHPC 更宽的浓度和温度范围内形成稳定的 bicelle，并且确定了 DMPC/CHAPSO 和 DLPC/CHAPSO 的流体动力学半径。我们还确认，即使在掺入肽后，半径也几乎没有变化。由于掺入 bicelle 中的 MPX-G 即使在低温下也能提供良好的 HSQC 谱图，因此 bicelle 有望对膜蛋白的 NMR 有效。 3. Magainin 2 通过在细菌细胞膜上打孔而具有杀菌作用，TRNOE 已确定当与脂质双层膜结合时会形成具有两个反向平行 α 螺旋的二聚体。为了证实这个结构是正确的，我们设计并化学合成了一个二聚体（SS二聚体），它在保持结构的同时用SS键交联。事实上，我们发现SS二聚体与单体magainin 2协同作用以增加单体的活性。