部分ペプチドを用いた蛋白質・蛋白質相互作用の解析

使用部分肽分析蛋白质-蛋白质相互作用

基本信息

批准号：
11160202
负责人：
若松馨
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Gunma University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11160202/
关键词：
G蛋白質レセプターマガイニン NMR 活性化立体構造

项目摘要

1.安定同位体でラベルしたペプチドを大腸菌で発現させる系を改良した。ペプチドはユビキチン(酵母よりクローニングしたもの)との融合蛋白質として発現していたが、ユビキチン遺伝子のcodon usageを大腸菌のものに合わせ、またコピー数を増やすことによって、約2倍の発現が得られるようになった。安定同位体化合物は高価なので、発現量が上がることによってラベルペプチドを用いた研究が推進されると期待される。2.レセブターがG蛋白質を活性化する機構について、「レセプターがG蛋白質αサブユニットのα5へリックスを解き、その構造変化がα5へリックスとβ2/β3ループの間のイオンペアによってグアニンヌクレオチド結合部位へと伝えられる」という仮説を我々は立てている。そのイオンペアを破壊した新たなmutantを作り、ムスカリン性レセプターとのカップリングを解析したところ、上記の仮説を更に支持する結果が得られた。また、αサブユニットの立体構造変化を解析する時に、今までスマトパランやcompound48/80で活性化していたが、より生理的であるm4ムスカリンレセプターの部分ペプチドでも同じ結果が得られた。このペプチドは大腸菌で良く発現されるので、活性化機構をNMRで解析するのに大変有用であると期待される。3.最近の細胞膜に穴をあけることによって殺菌作用を示すマガイニン2の脂質二重膜中の立体構造をNMRで決定した。TRNOEによる解析の結果、主鎖について0.43Åという精度の高い構造を決定することができた(PDB ID code:1DUM)。脂質二重膜に結合した時、マガイニン2は2本のαへリックスが逆平行になったダイマーを形成することが明らかとなった。個の構造を基にすれば殺菌活性のより高いペプチドがデザインでき、新たな構成物質の開発にも結びつくと期待される。

1. 我们改进了在大肠杆菌中表达稳定同位素标记肽的系统。该肽与泛素（从酵母克隆）融合蛋白表达，但通过将泛素基因的密码子使用调整为大肠杆菌的密码子使用并增加拷贝数，可以获得约两倍的表达量。。由于稳定同位素化合物价格昂贵，因此预计表达水平的增加将促进使用标记肽的研究。 2. 关于受体激活G蛋白的机制，``受体解开G蛋白α亚基的α5螺旋，结构变化通过α5螺旋和α5螺旋之间的离子对导致鸟嘌呤核苷酸结合位点我们假设可以说是这样的。当我们创建了一个新的突变体，该离子对被破坏并分析了其与毒蕈碱受体的偶联时，我们获得了进一步支持上述假设的结果。此外，在分析α亚基的构象变化时，我们之前用sumatoparan或化合物48/80激活它，但使用m4毒蕈碱受体的更生理性的部分肽也获得了相同的结果。由于该肽在大肠杆菌中良好表达，因此预计对于活化机制的 NMR 分析非常有用。 3.通过NMR测定了通过在细胞膜上打孔而具有杀菌作用的magainin 2在脂质双层膜中的三维结构。通过 TRNOE 分析，我们能够以 0.43 Å 的高精度确定主链结构（PDB ID 代码：1DUM）。当与脂质双层结合时，magainin 2 被发现形成具有两个反向平行 α 螺旋的二聚体。基于个体结构，可以设计出具有更高杀菌活性的肽，这有望导致新组成物质的开发。