2平面間に両端捕捉されたミオシンS1の動的構造変化と力発生の同時計測

同时测量捕获在两个平面之间两端的肌球蛋白 S1 的动态结构变化和力的产生

基本信息

批准号：
12030222
负责人：
須田斎
金额：
$ 1.73万
依托单位：
Tokai University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

筋収縮は、ミオシンとアクチンとの相互作用によって起こる。通常のモデルからは、力発生はミオシンがすべて行なっている可能性が推測される。しかし、ミオシンとアクチンとの界面で発生している可能性もあり、いまだにこの問いに対する答えはない。そこで、ミオシンのみで力発生をしているという仮定の下に、ミオシンの力発生を表面力測定装置で直接測定するために、我々はミオシンの2点を捕捉できるように遺伝子組換え技術を用い融合蛋白質を作製した。これは、東京大学の須藤和夫教授のご協力により可能となった。また、このような蛋白を捕捉する為に、石英薄膜をECRスパッターでマイカ基板上に蒸着してそれぞれの面を化学修飾して機能化させた。スパッター装置は、本学の後藤顕也教授のご好意により使用することが可能となった。すべての過程は別の実験を行なって完成度が高いことを確認した。例えば、石英薄膜上への化学修飾の定量化は、水晶振動子マイクロバランスにより吸着過程、吸着密度を詳細に測定した。遺伝子組換えしたミオシンのATPase活性やアクチンフィラメントの運動活性能のチェックを行い、抽出したミオシンの活性があることを確認した。実験では、ミオシンを2点捕捉後、直ちにUV照射によりATP加水分解反応を開始できるように、caged-ATP試薬を使用した。UVによるアーティファクトを排除するために、ウサギ骨格筋から調整した筋原線維を用いてUV照射量による収縮速度減少を定量化した。実際に実験で使用するUV照射量ではほとんど活性を低下させないことがわかった。また別に、UVによるダメージによる効果ではないことをcaged-ATP試薬のない場合の実験で確認した。遺伝子組換えミオシンは、構造変化を伴って平均0.7pN以上の力発生を行なうことが結論された。筋収縮の力発生は、ミオシンがすべてを請け負っていることが明らかになった。

肌肉收缩是通过肌球蛋白和肌动蛋白的相互作用发生的。传统模型表明肌球蛋白可能负责所有力的产生。然而，有可能它发生在肌球蛋白和肌动蛋白之间的界面处，这个问题仍然没有答案。因此，为了用表面力测量装置直接测量肌球蛋白产生的力，我们利用基因重组技术捕获肌球蛋白上的两个点，假设肌球蛋白单独产生力，从而创建了一种融合蛋白。这是在东京大学须藤一夫教授的合作下实现的。为了捕获此类蛋白质，使用 ECR 溅射将石英薄膜沉积在云母基板上，并对每个表面进行化学修饰以使其具有功能。感谢本校后藤晃也教授的热心帮助，溅射设备得以投入使用。通过单独的实验证实所有过程都高度完整。例如，为了量化石英薄膜上的化学修饰，我们使用石英晶体微天平详细测量了吸附过程和吸附密度。我们检查了转基因肌球蛋白的ATP酶活性和肌动蛋白丝的运动活性，并确认提取的肌球蛋白具有活性。实验中使用笼状ATP试剂，通过紫外线照射在两点捕获肌球蛋白后立即启动ATP水解反应。为了消除紫外线引起的伪影，我们使用从兔子骨骼肌制备的肌原纤维来量化紫外线照射下收缩速度的降低。结果发现，实验中使用的紫外线照射量并没有显着降低活性。另外，我们在没有笼式 ATP 试剂的实验中证实，这种效应不是由于紫外线损伤造成的。结论是，转基因肌球蛋白产生的平均力超过 0.7 pN，且结构发生了变化。很明显，肌球蛋白负责在肌肉收缩过程中产生力量。