配向制御されたミオシン単分子層による動的構造変化と発生力の同時計測

同时测量定向控制肌球蛋白单层的动态结构变化和产生的力

基本信息

批准号：
11156101
负责人：
須田斎
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Tokai University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ミオシンモーター分子の構造変化と力発生を同時計測することを目的に、固体表面上にS1単分子層を形成させて実験を行った。細胞性粘菌による変異性ミオシンS1の2点間捕捉は、一端はC末の反応性の高いシステインを銀薄膜上に単分子膜状に形成されたマレイミド基で捕捉した。他端は、今回アクチン結合部位周辺とマイカ面のs的相互作用で結合させた。ATP加水分解反応は、Caged-ATPを用い、UV光照射により開始させた。白色光で干渉させ分光器に入れて、平面間隔をサブナノメートル精度で測定する。その光路にダイクロイックミラーを入れて、S1単分子層にUV光を入れる。表面間距離約10nmでUV照射(18秒)して表面間距離が0.7nm変化した。この時のS1一個当たりの出す力は接触面積と占有面積とから約0.1pNと見積もられた。これは、細胞性粘菌のミオシンが出すと予想される力とほぼ一致している。UV照射に伴うダメージ、ならびに膜厚の変化はないことは60秒のUV照射で確認←た。また、別の案験においてUV照射18秒間でCaged-ATPがATPに変化する濃度は、0.3mMであることを見積もった。ただし、この測定では出す力に比べて強く押した条件で測定したために、強く押したことによる構造変化の可能性を排除することができない。今後は、基板としてすべてガラス蒸着薄膜を用いて、片方の面は同様にマレイミド化しS1-C末のシステインを捕捉する。一方His-tagをS1のアクチン結合部位周辺に組み込み他面のガラス蒸着薄膜上をNTA化してS1の捕捉を行う。これにより、構造変化がよりスムーズに行える空間的な自由度を持たせることが可能となる。

为了同时测量肌球蛋白运动分子的结构变化和力的产生，我们通过在固体表面形成 S1 单层进行了实验。在盘基网柄菌对突变肌球蛋白S1的两点捕获中，C末端高反应性半胱氨酸的一端被银薄膜上以单层形式形成的马来酰亚胺基团捕获。另一端通过云母表面之间的s型相互作用与肌动蛋白结合位点附近结合。使用笼状 ATP 通过紫外光照射引发 ATP 水解反应。干涉白光并将其放入光谱仪中，可以以亚纳米精度测量平面间距。光路中放置了一个二向色镜，将 UV 光引导至 S1 单层。表面到表面距离约为 10 nm 的 UV 照射（18 秒）导致表面到表面距离发生 0.7 nm 的变化。根据接触面积和占用面积估计此时每个 S1 施加的力约为 0.1 pN。这大致与盘基网柄菌中肌球蛋白预期施加的力相匹配。确认UV照射60秒后，没有因UV照射而造成的损伤或膜厚变化。此外，在另一项实验中，在紫外线照射 18 秒后，笼状 ATP 转化为 ATP 的浓度估计为 0.3mM。然而，由于该测量是在材料受到的压力大于所施加的力的条件下进行的，因此不能排除强压力导致结构变化的可能性。未来，我们将使用玻璃气相沉积薄膜作为基板，一侧类似地转化为马来酰亚胺，以捕获S1-C端的半胱氨酸。另一方面，在S1的肌动蛋白结合位点周围插入His标签，另一侧的玻璃气相沉积薄膜转化为NTA以捕获S1。这使得可以提供一定程度的空间自由度，其中可以更顺利地进行结构变化。