配向制御されたミオシン単分子層による動的構造変化と発生力の同時計測

同时测量定向控制肌球蛋白单层的动态结构变化和产生的力

基本信息

  • 批准号:
    11156101
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 1.79万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
  • 财政年份:
    1999
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    1999 至 无数据
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

ミオシンモーター分子の構造変化と力発生を同時計測することを目的に、固体表面上にS1単分子層を形成させて実験を行った。細胞性粘菌による変異性ミオシンS1の2点間捕捉は、一端はC末の反応性の高いシステインを銀薄膜上に単分子膜状に形成されたマレイミド基で捕捉した。他端は、今回アクチン結合部位周辺とマイカ面のs的相互作用で結合させた。ATP加水分解反応は、Caged-ATPを用い、UV光照射により開始させた。白色光で干渉させ分光器に入れて、平面間隔をサブナノメートル精度で測定する。その光路にダイクロイックミラーを入れて、S1単分子層にUV光を入れる。表面間距離約10nmでUV照射(18秒)して表面間距離が0.7nm変化した。この時のS1一個当たりの出す力は接触面積と占有面積とから約0.1pNと見積もられた。これは、細胞性粘菌のミオシンが出すと予想される力とほぼ一致している。UV照射に伴うダメージ、ならびに膜厚の変化はないことは60秒のUV照射で確認←た。また、別の案験においてUV照射18秒間でCaged-ATPがATPに変化する濃度は、0.3mMであることを見積もった。ただし、この測定では出す力に比べて強く押した条件で測定したために、強く押したことによる構造変化の可能性を排除することができない。今後は、基板としてすべてガラス蒸着薄膜を用いて、片方の面は同様にマレイミド化しS1-C末のシステインを捕捉する。一方His-tagをS1のアクチン結合部位周辺に組み込み他面のガラス蒸着薄膜上をNTA化してS1の捕捉を行う。これにより、構造変化がよりスムーズに行える空間的な自由度を持たせることが可能となる。
通过在固体表面上形成S1单层来进行实验,以同时测量肌球蛋白运动分子的结构变化和力产生。为了通过细胞粘液霉菌捕获突变的肌球蛋白S1,其一端是由在银色薄膜上以单层样形式形成的maleimide基团捕获了C末端的高反应性半胱氨酸。现在,另一端是由云母表面与肌动蛋白结合位点之间的相互作用结合的。通过使用Cage-ATP紫外线照射开始ATP水解反应。通过干扰白光并将其放置在光谱仪中,以子纳米的精度测量平面间距。将二分色镜放置在光学路径中,并将紫外线放在S1单层中。在表面距离处的紫外线照射(18秒)用0.7 nm变化。目前,根据接触面积和占用区域,每S1产生的力估计约为0.1 pn。这大致与预期由细胞粘液肌球蛋白释放的力一致。我们证实,紫外线照射不会造成损害,或者在60秒内不会随着紫外线照射而改变膜厚度。在另一个实验中,估计在紫外线照射的18秒钟对ATP变化的浓度为0.3 mm。但是,该测量是在将力推高的力比产生的力更难的条件下进行的,因此无法消除由于强劲推动而导致的结构变化的可能性。从现在开始,所有底物都是由玻璃沉积的薄膜制成的,一侧将以相同的方式进行恶化,以捕获S1-C端子的半胱氨酸。另一方面,将HIS标签掺入了S1的肌动蛋白结合位点,NTA用于将沉积在另一表面上的玻璃薄膜转换以捕获S1。这允许空间自由,可以使结构变化更加顺利。

项目成果

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