C4植物由来炭酸固定酵素PEPCのリン酸化による反応制御機構の解明

阐明C4植物源碳酸固定酶PEPC磷酸化的反应控制机制

基本信息

批准号：
12025218
负责人：
甲斐泰
金额：
$ 0.9万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

C4植物であるトウモロコシの葉からPEPCの大量精製を行い、精製酵素についてMg^<2+>および基質類似物との共結晶化を行った。X線構造解析に適した結晶について、X線構造解析を行った。本結晶は、格子定数が大きいため回折強度が弱く、本研究室にある回転対陰極型X線発生器とX線検出器RAXIS IIcでは精度の高い回折強度データを得ることができない。よって、強力なX線源を用いて回折強度データを収集する必要がある。そこで、平成12年度には高純度サンプルの精製を繰り返し行うことによって、結晶化に必要な大量のサンプルを入手し、結晶化を行った。このために、精製試薬、カラム用充填剤、高純度結晶化試薬の大量に購入した。得られた結晶を用い、播磨SPring-8あるいは筑波高エネルギー物理学研究機構におけるシンクロトロン放射光により、基質類似物・阻害剤非結合型結晶のX線回折強度データの収集を行った。その後、DENZOとSCALEPACKという処理プログラムを用いて回折強度データからFデータを得、構造解析とその精密化を行った。これまでに得られている阻害剤結合型PEPC(大腸菌由来)の立体構造と比較した結果、トウモロコシ由来PEPCの活性部位の構造が大きく変化し、活性型酵素について、多くの新しい構造化学的知見が得られた。

PEPC从玉米的叶子（即C4植物）中得到质量强化，并用Mg^<2+>和底物相似性进行纯化的酶。对适合X射线结构分析的晶体进行了X射线结构分析。该晶体具有较大的晶格常数，因此衍射强度较弱，并且在该实验室中旋转 - 电极-Type X -Ray Generator，并且X -RAR检测装置Raxis IIC无法获得高 - 准确性衍射强度数据。因此，有必要使用功能强大的X线源来收集衍射强度数据。因此，在第28财年，重复对高纯度样品的重复精炼，以获得结晶和结晶所需的大量样品。因此，我们购买了大量纯化的试剂，柱填充和高纯度结晶试剂。使用所获得的晶体，Harima Spring-8或Tsukuba高能物理科学研究组织的同步辐射灯收集了底物相似性的X射线折叠强度数据，并抑制了非结合晶体。后来，使用称为Denzo和ScalePack的处理程序，从衍射强度数据，结构分析及其精度获得了F数据。由于比较到目前为止获得的抑制剂型PEPC（大肠杆菌衍生）的三维结构的结果，玉米衍生的PEPC的活性部分的结构发生了很大变化，许多关于许多新的关于新的结构性知识，许多新的结构知识知识活跃的酶。