コンビケムを用いた糖鎖認識ペプチドリガンドの取得

使用 Combichem 获得碳水化合物链识别肽配体

基本信息

批准号：
12019242
负责人：
福崎英一郎
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

細胞表層の糖鎖の細胞間認識への関与は明らかであり、糖鎖のタンパク質による分子認識機構の解明の重要性が増してきた。ところが、タンパク質・タンパク質間の分子認識と異なり、糖とタンパク質の結合様式は水素結合に大きく依存しており、特異的レセプターの取得も一般に困難である。本研究では、糖鎖認識機構解明の一助として糖鎖を認識するペプチド配列を取得することを目的とした。また、ファージディスプレイライブラリーから水素結合〓たる結合様式であるペプチドリガンドを取得するための方法論の確立を目的とした。認識様式が水素結合に大きく依存し、分子認識が困難である中性糖(キチンあるいはセルロース)をターゲットとした。ペプチドライブラリーとして、繊維状ファージの表面抗原にランダムペプチドを提示したファージディスプレイランダムペプチドライブラリーを用いた。(1価型および5価型の両者を使用した。)パニングを行う際のマトリクスとして、疎水性相互作用の少ない、親水性マトリクスを用いた。chito-oligoagaroseをターゲットとして、5価型ファージライブラリーをスクリーニングしたところ、ラウンドを重ねる度に宿主大腸菌への感染率の低下が観測された。マトリクスを磁気ビーズに変えた場合にも同様の傾向が認められた。そこで、繊維状ファージのg3p抗原にトリプシンインヒビターの一部分を融合タンパク質として提示し、突起部分にランダムペプチド配列を有する1価型のライブラリーに変更した。パニングに際し、疎水性相互作用による非特異吸着を減じるために、60%EtOHで洗浄を行い、尿素溶出により回収した。6ラウンド終了後のファージをSPRセンサーチップ表面に固定化し、オリゴキチンとの相互作用を調べたところ、特異的吸着が認められた。

糖在表面细胞层中参与细胞间识别是明显的，并且通过聚糖蛋白阐明分子识别机制的重要性也有所增加。但是，与蛋白质和蛋白质之间的分子识别不同，糖和蛋白质之间的结合模式在很大程度上取决于氢键，并且通常很难获得特定的受体。这项研究旨在获取肽序列，这些肽序列将聚糖识别为阐明聚糖识别机制的帮助。目的是建立一种方法来获得从噬菌体显示文库中具有氢键结合模式的肽配体的方法。高度依赖氢键并且难以识别分子的中性糖（几丁质或纤维素）是针对的。作为肽文库，使用噬菌体显示随机肽文库，其中使用了随机肽将随机肽呈现到丝状噬菌体的表面抗原。（使用了单价和五体形式。）作为平移的基质，使用了几乎没有疏水相互作用的亲水基质。当筛选五体噬菌体文库用壳聚糖 - 橄榄石作为目标时，每轮都会观察到宿主大肠杆菌的感染率降低。当矩阵更改为磁珠时，观察到类似的趋势。因此，将一部分胰蛋白酶抑制剂作为与丝状噬菌体G3P抗原的融合蛋白一起呈现，并将其更改为具有突起时随机肽序列的单价文库。在平移过程中，为了减少由于疏水相互作用而引起的非特异性吸附，将混合物用60％EtOH洗涤，并通过尿素洗脱恢复。六回合后，将噬菌体固定在SPR传感器芯片的表面上，并检查了与寡素的相互作用，并观察到了特定的吸附。