コンビケムを用いた糖鎖認識ペプチドリガンドの取得

使用 Combichem 获得碳水化合物链识别肽配体

基本信息

批准号：
11132242
负责人：
福崎英一郎
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1)糖鎖を認識するペプチド配列のスクリーニング多糖(キチン,セルロース)を標的として、M13ファージランダムペプチドライブラリーを探索源として、カラム法および、磁気ビーズ法を用いてスクリーニングを行った。結果として、chito-agaroseカラムをマトリクスにして、水素結合を強調する条件(60%EtOH)で洗浄後、水素結合を弱める条件(高濃度糖、高濃度多価アルコール)で溶出を試みたが、数ラウンド後に急激な回収率の低下が認められた。また、cellulose磁気ビーズをマトリクスにして、上記と同様の洗浄・溶出条件でセレクションを行ったが、同様に数ラウンド後に回収率が低下した。上記の磁気ビーズセレクションと同様の吸着・洗浄の後にフェノールによる強制溶出を行うセレクションを行い、4ラウンド後にシークエンス解析を行ったところ、グリシン出現頻度の低下およびプロリン出現頻度の上昇が観測された。磁気ビーズを直接感染させてファージ増幅率を調べたところ、3時間感染と5時間感染との間で顕著な違いが無かった。それらの結果から、中性糖の認識能とM13ファージ感染能との間に負の相関が示唆された。2)糖鎖を認識DNAアプタマ-の取得59残其のランダムDNAライブラリーからインビトロセレクション法により取得したキチンを認識するDNAアプタマ-の選択性を評価し、下記の仮説を得た。DNAアプタマ-が多糖を認識するには、バルジループあるいは、ステムループ等のループ構造が必須である。(G-カルテット構造ではない。)類似多糖類に対する選択性は、ループの数が3個以上の場合高くなる。ループ数が1の場合は、糖に対する親和性は認められるが基質認識能は低い。

1）使用柱和磁珠使用M13噬菌体随机肽库作为搜索源进行筛选识别糖合成筛查的肽序列。结果，在用壳聚糖柱作为基质洗涤后，强调了氢键（60％ETOH），在弱化的氢键（高浓度糖，高浓度多氢醇）的条件下尝试了溶液，但是几次后观察到了恢复速率的突然降低。此外，纤维素磁珠被用作基质，并在与上述相同的清洁和洗脱条件下进行选择，但同样，几轮后的回收率下降。与上述磁珠选择相同的吸附和洗涤，然后用苯酚强迫洗脱，并在4轮后进行了测序分析，并且观察到甘氨酸外观的频率降低和脯氨酸外观频率的增加。当通过磁珠直接感染噬菌体扩增速率时，3小时和5小时感染之间没有显着差异。这些结果表明中性糖识别和感染性M13噬菌体的能力之间存在负相关。 2）评估了从随机DNA文库中剩余的糖基化DNA Aptamas 59，以选择通过体外选择方法获得的几丁质识别的DNA Aptamas的选择性，并获得了以下假设。为了使DNA适体识别多糖，必不可少的环状结构（例如凸起环或茎环）。（不是G四分之一的结构。）当环路数为3或更多时，相似多糖的选择性会增加。当环路数为1时，观察到糖的亲和力，但底物识别能力较低。