遺伝子破壊による葉緑体遺伝子の機能解析

通过基因破坏进行叶绿体基因的功能分析

基本信息

批准号：
11151222
负责人：
鹿内利治
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Nara Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11151222/
关键词：
葉緑体 ATP依存的プロテアーゼ遺伝子破壊タバコ

项目摘要

これまでにタバコを用いた葉緑体形質転換により、原核生物型のATP依存的プロテアーゼの活性サブユニットをコードするclpPが、葉緑体分化の様々な時期に重要な機能を果たすことを明らかにしてきた。またclpPは細胞機能に必須で、完全な破壊は不可能であった。今年度は、光ピンセットによる葉緑体の分離を使って、葉緑体レベルでの表現型を葉緑体ゲノム組成との相関を単一葉緑体レベルで調べることを試みた。葉緑体の分離系は確立されたものの、単一葉緑体のゲノムの組成を定量的に解析することは困難であった。またclpPのコンディショナルな破壊系を確立するステップとして、clpP遺伝子の核ゲノムへの移行を行った。clpP遺伝子をrbcSの葉緑体移行シグナルの下流に繋ぎ、35SとrbcSプロモーターのコントロール下でタバコの核ゲノムに導入した。形質転換にはclpPの部分破壊株の他、clpPの大量発現の影響を調べる目的で野生株を用いた。形質転換にはcplPクチノマイシンを含む培地上での維持が必要なため、カナマイシンとの二重選抜が必要となる。そこでこの影響を調べる目的で、スペクチノマイシン耐性遺伝子のみをもつコントロール株への導入もあわせて行った。ウエスタン解析により、野生株とコントロール株でClpPを大量発現する個体が多数得られたことを確認した。大量発現株に共通する形態異常は現在のところ観察されていない。今後、葉緑体レベルでの解析を行う予定である。一方clpP破壊株では、形質転換効率が極めて低かったものの、形質転換体を得ることに成功した。植物の生育を持って、葉緑体ゲノム解析、表現型の回復の有無を調べる。

迄今为止，使用烟草的叶绿体转化已证明表明，编码原核ATP依赖性蛋白酶的活性亚基的CLPP在叶绿体分化的不同时期起着重要功能。此外，CLPP对于细胞功能至关重要，不可能完全破坏它。今年，我们试图将叶绿体分离与光学镊子一起研究叶绿体水平上表型与单个叶绿体水平上叶绿体基因组组成的相关性。尽管已经建立了叶绿体分离系统，但很难定量分析单个叶绿体的基因组的组成。此外，作为建立CLPP条件破坏系统的步骤，将CLPP基因转移到核基因组中。将CLPP基因连接到RBC的叶绿体转移信号的下游，并在35S和RBCS启动子的控制下引入烟草核基因组中。除了部分破坏的CLPP菌株外，野生菌株还用于转化，以研究大量CLPP表达的影响。转化需要在含有CPLP ctinomycin的培养基上进行维护，因此需要对卡纳米霉素进行双重选择。因此，为了研究这种作用，我们还将该菌株引入了仅具有光霉素耐药基因的对照菌株。西方分析证实，在野生和对照菌株中获得了许多表达大量CLPP的个体。目前尚未观察到高表达菌株常见的形态异常。我们计划将来进行叶绿体分析。另一方面，尽管转化效率在CLPP中断应变中极低，但我们能够获得转化体。随着植物的生长，检查了叶绿体基因组分析和表型恢复。