遺伝子破壊による葉緑体遺伝子の機能解析

通过基因破坏进行叶绿体基因的功能分析

基本信息

批准号：
09274221
负责人：
鹿内利治
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Nara Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09274221/
关键词：
葉緑体葉緑体形質転換プロテアーゼ ATPase 光合成

项目摘要

植物の葉緑体ゲノムには、原核生物型のATP依存的タンパク質分解に関与するClp複合体の活性サブユニットをコードする遺伝子clpPがコードされている。本研究はタバコ葉緑体形質転換技術を用いてclpPの遺伝子破壊を行い、葉緑体におけるATP依存的タンパク質分解の生理機能を明らかにすることを目的とする。タバコ葉緑体よりclpPを含む断片をクローン化し、clpPと置換する形でスペクチノマイシン耐性を付与するaadAカセットを挿入したコンストラクトを構築した。また下流の遺伝子の発現に与える影響を考慮するコントロールとして、clpPの下流に遺伝子を破壊しない形でaacAカセットを挿入したコンストラクトも構築した。両コンストラクトをパーティクルガンを用いてタバコ葉緑体に導入した。遺伝子破壊株の葉緑体ゲノムは、組換え体分子と野生型分子それぞれおよそ50%ずつにより構成されるヘテロプラズミックな状態にあった。一方コントロール株の葉緑体ゲノムは、サザンハイブリダイゼーションの感度ではすべて組換え型分子に置き換わっていた。形質転換体のシュートをスペクチノマイシンの選択圧下、ホルモンフリーの培地上で発根させたところ、コントロール株では正常な植物体が得られたが、遺伝子破壊株では葉脈が乱れ、著しい葉の形態異常が見られた。さらに葉緑体形質転換体より培地細胞を誘導し、スペクチノマイシンを含む培地上で増殖させた。コントロール株から誘導された培養細胞は緑色で良好に増殖したが、遺伝子破壊株の培養細胞は黄色で著しく生育が悪かった。遺伝子破壊株の葉緑体ゲノムの構成比は、シュートに比べて培養細胞で組換え型分子の占める割合が増加していたが、すべて組換え型分子に置換されることはなかった。このことからclpPの機能は細胞の増殖に必須であることが示唆された。

植物的叶绿体基因组用CLPP编码，CLPP编码CLP复合物的活性亚基，该亚基参与了核类型的ATP依赖性蛋白水解。这项研究旨在使用烟草叶绿体转化技术破坏CLPP基因，以阐明叶绿体中ATP依赖性蛋白水解的生理功能。构造了一个构造，其中将含有CLPP的片段从烟草叶绿体中克隆，并用AADA盒子代替，该盒子以Clpp的形式赋予了镜头抗霉素的耐药性。此外，还构建了一个构造，其中将AACA盒插入了CLPP的下游，而不会破坏基因作为对照，以考虑下游基因表达的影响。使用颗粒枪将两种构造都引入烟草叶绿体中。基因破坏菌株的叶绿体基因组处于异质状态，由大约50％的重组和野生型分子组成。另一方面，对照菌株的叶绿体基因组被重组分子在南部杂交的敏感性中取代。当转化体的芽在尺寸霉素的选择性压力下植根于无激素培养基上时，在对照菌株中获得了正常植物，但在基因脱离的菌株中破坏了静脉，观察到明显的叶片形态。此外，培养基细胞是从叶绿体转化体中诱导的，并在含有光霉素的培养基上生长。源自对照菌株的培养细胞是绿色的，生长良好，而基因破坏菌株的培养细胞为黄色，生长明显较差。与芽相比，培养细胞中基因破坏菌株的叶绿体基因组的组成比增加了，但没有一个被重组分子代替。这表明CLPP的功能对于细胞增殖至关重要。