分子モーター間に働く相互作用の1分子イメージング

分子马达之间相互作用的单分子成像

基本信息

批准号：
10175222
负责人：
徳永万喜洋
金额：
$ 1.98万
依托单位：
National Institute of Genetics
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

生体分子モーターの分子レベルでの機構解明を目的として、生体分子1個を生きたまま捕まえ操作する新しい技術を開発した。翻訳後修飾によりビオチン化されるタンパク質との融合タンパク質を用いる方法により、アビジン・ビオチン系を使って、タンパク質を生きたまま表面に固定する方法を確立した。この方法で捕捉したミオシン頭部1分子が、ATP存在下でアクチンと相互作用して発生する力を計測する事に成功した。分子サイズ(20nm)を越えるスパイク状の変位が観測された。しかも、この大きな変位は、1個のATP加水分解中に5.3nmのステップが複数回起こって実現している事が発見された。さらに、この5.3nmステップが、ミオシン頭部の構造変化に基づくものか、アクチン・モノマーの間隔に基づくものかを決定する実験を行った。ミオシン頭部(S1)を,BDTC(ビオチン化ペプチド)と制御軽鎖(RLC)とのフュージョンペプチドを用いてアビジン経由でガラス表面に結合させると,双頭のミオシンと同程度に速く滑り運動することを見つけている。この系において,BDTCとRLCとの間にグリシン・リッチであるフレキシブルなペプチドを導入し,滑り運動の変化を計測した。最大12nmまで伸びうる柔らかいペプチドを導入しても、アクチンフィラメントは、導入する前の8割の速さで滑ることがわかった。以上の結果は、従来言われてきた構造変化説では説明できず、滑り運動の原動力として揺らぎを使った確率的な分子機構モデルを支持している。

为了在分子水平上阐明生物分子马达的机制，我们开发了一种捕获和操纵单个活生物分子的新技术。我们建立了一种使用抗生物素蛋白-生物素系统将蛋白质活体固定在表面的方法，使用具有通过翻译后修饰生物素化的蛋白质的融合蛋白。我们成功测量了使用这种方法捕获的单个肌球蛋白头分子在 ATP 存在下与肌动蛋白相互作用时产生的力。观察到超过分子尺寸（20 nm）的尖峰状位移。此外，还发现这种大位移是通过一个 ATP 水解过程中发生的多个 5.3 nm 步长实现的。此外，我们还进行了实验以确定这个 5.3 nm 的台阶是否是由于肌球蛋白头部的结构变化或肌动蛋白单体的间距造成的。当肌球蛋白头 (S1) 使用 BDTC（生物素化肽）和调节轻链 (RLC) 的融合肽通过亲和素结合到玻璃表面时，它的滑动速度与双头肌球蛋白一样快。在该系统中，在 BDTC 和 RLC 之间引入富含甘氨酸的柔性肽，并测量滑动运动的变化。即使在引入可拉伸至 12 nm 的软肽后，肌动蛋白丝的滑动速度也比引入之前快了 80%。上述结果无法用常规的结构变化理论来解释，支持了以涨落作为滑动运动驱动力的随机分子机制模型。