分子間相互作用の可視化と細胞内分子定量イメージング

分子相互作用的可视化和细胞内分子的定量成像

基本信息

批准号：
11242206
负责人：
徳永万喜洋
金额：
$ 115.2万
依托单位：
National Institute of Genetics
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2003
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11242206/
关键词：
1分子イメージング 1分子ナノテクノロジー薄層斜光照明法蛍光顕微鏡細胞質核間分子輸送定量的画像解析分子機構定量解析対物レンズ型全反射照明法低角斜光照明法細胞質核間輸送対物レンズ型全反射照明共焦点顕微鏡核輸送

项目摘要

細胞内部の蛍光1分子イメージングを、薄層斜光照明法を用いて行い、細胞内部での分子数と分子間相互作用を定量的に解析した。細胞質・核間輸送を担うImportin beta分子と核膜孔複合体との相互作用に関し、1分子と核膜孔1個との蛍光強度比から、結合分子数を定量した。濃度を変え、核膜孔との結合分子数・結合定数を求めた。その結果、2種類の結合部位があることが見つかり、弱い結合部位は、最大結合分子数110(+60,-40)個、解離定数70(+50,-30)nM、強い結合部位は、最大結合分子数7(+6,-4)個、解離定数0.3(+0.2,-0.1)nMであった。核膜孔複合体の構造には8回対称性があるので、強い結合部位の個数は、8個(もしくは16個)と推定される。1分子像の経時変化から、Importin betaと核膜孔複合体の結合時間(滞在時間)を求め、弱い結合が約1秒、強い結合が6秒以上、輸送中が約3秒であった。核内移行の輸送活性を蛍光像から直接計測したところ、細胞レベルの核内輸送速度と、以上の1分子計測で求めた値とがよく一致し、1分子解析による新しい手法が有用であることを示した。強い結合部位は核膜孔通過と密接な関係にあり、弱い結合部位はたくさんの分子を結合させて輸送される分子を集める役割を果たしていると考えられる。相互作用の強弱および変化により選択的な通過を実現しており、たくさんの分子を集めることにより通過速度を速めているという、新しいモデルを提案した。

利用薄层倾斜照明进行细胞内单分子荧光成像，定量分析细胞内分子数量和分子间相互作用。关于负责细胞质和细胞核之间的转运的Importin β分子与核孔复合体之间的相互作用，根据1个分子与1个核孔的荧光强度比来定量结合分子的数量。通过改变浓度来确定与核膜孔结合的分子数量和结合常数。结果发现，存在两种类型的结合位点：弱结合位点的最大结合分子数为110（+60，-40），解离常数为70（+50，-30）nM ，强结合位点如下：最大结合分子数为7（+6，-4），解离常数为0.3（+0.2，-0.1）nM。由于核孔复合体的结构具有8重对称性，因此强结合位点的数量估计为8（或16）。从单分子图像的时间过程确定Importin beta和核孔复合物之间的结合时间（停留时间），发现弱结合约为1秒，强结合超过6秒，约3秒。运输过程中的秒数。当直接从荧光图像测量核转运活性时，细胞水平的核转运速率与上述单分子测量确定的值非常一致，证明了基于单分子分析的新方法的有用性。强结合位点与通过核孔密切相关，弱结合位点被认为起到结合许多分子并收集待运输分子的作用。我们提出了一种新模型，通过改变相互作用的强弱来实现选择性通过，并通过聚集许多分子来提高通过率。