Development of integrative methods for correlative studies among dynamics, nano-localization, and function using simultaneous multi-color single-molecule and super-resolution imaging

使用同时多色单分子和超分辨率成像开发动力学、纳米定位和功能之间相关研究的综合方法

基本信息

批准号：
22H02581
负责人：
徳永万喜洋
金额：
$ 11.15万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

「分子を観て、機能を知る」ために、申請者らが開発した超解像１分子多種同時イメージング法を統合的に用い、動態・ナノ局在・機能“場”同時、かつ、多種分子同時の分子イメージング、多種類データ取得、多様な時空間定量データ群を統合的に相関解析し、分子機能を解明する『動態・ナノ局在・機能相関学』を創出することを目的として、次を行った。１．超解像１分子多種同時イメージング顕微鏡の改良。『動態・ナノ局在・機能相関学』創出に必要な性能を満たすべく、高精度高速超解像イメージングと１分子蛍光イメージングを生細胞で同時観察できる４色までの多色対応蛍光顕微鏡として、現有設備を改良した。２．蛍光標識分子の調製。超解像用にはphoto- switchable fluorescent proteins、１分子イメージング用にはGFP/SNAP-tag蛍光色素などを、目的タンパク質遺伝子(RNAポリメラーゼII、転写制御分子等)に導入した。３．１分子イメージング動態解析。申請者らの開発した移動部分軌跡解析法を用い、１分子イメージング軌跡追跡により、分子動態を時間・空間の関数として定量計測した(Sci Rep, 2017)。部分軌跡を全軌跡中で１点ずつずらしてゆくことで経時変化を追い、動態・分子間相互作用情報を時間・空間の関数として定量した。４．超解像解析。局在化方式(PALM/STORM) 超解像画像を、20～30 nm程度以上の高精度にてナノ局在解析した。５．領域マーカー対応。超解像と１分子軌跡の重ね合わせ画像（2～3色）に、1～2色の領域マーカー画像を重ね合わせ、分子局在・分子動態・相互作用を、注目領域と関連付けながら、時間・空間の関数として定量した。６．cluster解析を行い、以上で得られたデータ郡を、相互に関連付けながら、一連の解析フローとして相関解析するプログラムシステムを構築した。

为了“观察分子、了解分子功能”，我们将整合申请人开发的超分辨率单分子、多物种同时成像方法，同时捕获多个物种的动力学、纳米定位和功能“场”。为了创建“动力学、纳米定位和功能相关性研究”，通过同步分子成像、多种类型的数据采集以及不同时空定量数据组的综合相关性分析来阐明分子功能，我们的目标是：我做到了。 1.超分辨单分子多物种同时成像显微镜的改进为了满足创建“动力学、纳米定位和功能相关性研究”所需的性能，我们开发了多色荧光显微镜，最多可支持四种颜色，可同时进行高精度、高速观察改进了现有设备的活细胞超分辨率成像和单分子荧光成像。 2.荧光标记分子的制备。用于超分辨率的光开关荧光蛋白和用于单分子成像的 GFP/SNAP 标签荧光染料被引入目标蛋白基因（RNA 聚合酶 II、转录控制分子等）。 3.1 分子成像动力学分析。使用申请人开发的移动部分轨迹分析方法，我们通过单分子成像轨迹跟踪定量测量了作为时间和空间函数的分子动力学（Sci Rep，2017）。通过在整个轨迹内一次移动一个点，我们跟踪了随时间的变化，并量化了动态和分子间相互作用信息作为时间和空间的函数。 4.超分辨率分析。定位方法（PALM/STORM）对超分辨率图像进行纳米定位分析，精度约为 20 至 30 nm 或更高。 5.支持区域标记。超分辨率和单分子轨迹叠加图像（2至3种颜色）与1至2种颜色区域标记图像叠加，分子定位、分子动力学和相互作用与感兴趣区域相关，并作为函数进行时间和量化的空间。 6.我们进行了聚类分析，构建了一个程序系统，将上面获得的数据组进行关联，并作为一系列分析流程进行相关性分析。