生体機能調節因子としてのテトラヒドロビオプテリンの分子生物学的研究

四氢生物蝶呤作为生物功能调节剂的分子生物学研究

基本信息

批准号：
10169258
负责人：
一瀬宏
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Fujita Health University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

テトラヒドロビオプテリンは、カテコールアミン生合成やNO合成に必須であり、多くの生理機能への関与が示唆されている。我々は、BH4の生合成律速酵素であるGTPシクロヒドロラーゼI(GCH)の酵素化学的性質を調べるために、ヒトGCHを大腸菌発現系により大量発現し精製酵素標品の解析を行った。ヒトGCHのcDNAを大腸菌のGST融合タンパク質発現用ベクターに組み込み、GST融合ヒトGCH(GST-hGCH)を発現させた。GST-hGCHの精製は、グルタチオンセファロースカラムとゲルろ過カラムを用いて行った。また、野生型GCHばかりでなく、優性遺伝するドーパ反応性ジストニア(HPD)においてみつかったミスセンス変異体(M88,M201)と、劣性遺伝形式の悪性高フェニルアラニン血症(HPA)でみつかった変異体(M184,M211)のそれぞれを大腸菌で発現させ精製した。ネイティブなGCHは、活性部位を5つのオリゴマーで形成し、これが上下に2つ重なった十量体を形成することが報告されている。ゲルろ過上の溶出位置とキネティクスの解析からM88、M184、M201はオリゴマー形成が正しく行われず失活していると考えられた。これに対して、M211はオリゴマー形成は正常に行われているようだったが、GTPに対する親和性が大きく低下していた。以上の結果から、GCHのオリゴマー形成および活性発現に重要なアミノ酸残基が明らかとなった。また、変異体の性状にHPDとHPAとで明確な違いがなかったことから、HPDの発症を決める要因はGCHタンパク質の性質以外にあることが示唆された。本補助金により購入した超低温フリーザーは、精製酵素の保存やヒトGTPシクロヒドロラーゼI発現大腸菌の保存などに有効に活用されている。

Tetrahiderobobi Optine对于儿茶酚胺原始合成至关重要，没有合成，这表明参与了许多生理功能。为了检查BH4的生物体速度酶GTP环氢酶I（GCH）的酶化学酶，我们通过大细菌表达系统分析了大量的人类GCH，并分析了纯化的酶。将人类GCH的cDNA掺入了大肠杆菌的GST融合蛋白表达的载体中，并表达了GST融合人类GCH（GST-HGCH）。 GST-HGCH精制是使用谷氨酸谷物柱和凝胶凝胶进行的。此外，不仅野生GCH，而且在DOPPA反应次反应术（HPD）中发现的其他突变体（M88，M201），它是显性的，并且在具有凹面遗传格式的恶性高苯丙氨酸血症（HPA）中发现了变量（HPA）。每个M184，M211）在大肠杆菌中表达并纯化。据报道，天然GCH形成了一个活跃的部分，有五个低聚物，在上下形成一个重叠的身体。凝胶滤光位置和动力学的分析被认为是无效的，因为寡聚体的形成未正确执行。另一方面，M211似乎正常进行低聚物形成，但是对GTP的亲和力大大降低了。以上结果表明，氨基酸残基对GCH低聚物形成和活性表达很重要。另外，HPD和HPA在突变体的特征中没有明显的差异，这表明确定HPD发作的因子除了GCH蛋白以外是其他的。该补贴购买的超低 - 温度冻结剂可有效地保存纯化的酶，并保留人GTP环氢酶I表达大肠杆菌。