In-situ PCR法を用いた植物の鉄栄養関連遺伝子の発現制禦の機構

原位PCR方法控制植物铁营养相关基因表达的机制

• 批准号: 08660071
• 负责人: 西澤 直子
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 1997
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08660071/
• 关键词: in-situハイブリダイゼーション法; 鉄欠乏; オオムギ; ids3; in-situ PCR法; 鉄栄養に関連する遺伝子群; 鉄による遺伝子発現制御機構; 液体ヘリウム急速凍結法

in-situハイブリダイゼーション法は組織中のどの細胞に目的とする遺伝子が存在し、また発現しているのかを検定する方法である。我々はこの方法を用いて鉄欠乏時に特異的に発現する遺伝子のひとつ、ids3がオオムギ根の中心柱付近に発現しており、それが組織内の鉄の存在部位と密接に関連することを明らかにした。しかし、ids3以外の他の遺伝子に関しては、その発現量が微量であるため検出不可能であった。そこで、組織内でPCRを行いDNAを増幅することによって微量の遺伝子を検出するin-situ PCR法の適用を考え、鉄栄養に関連する遺伝子群の鉄による発現制御の機能を明らかにすることを最終目標として、植物材料を用いてこれをおこなう場合の最適条件を確立することを目指した。in-situ PCR法はまず組織切片上でPCRを行う。その後、組織内で増幅されたDNA断片をハイブリダイゼーションにより検出する。検出のためのプローブの標識はジゴキシゲニンとラジオアイソトープの両方を用いた。この方法は組織切片を用いてPCRを行うので、耐熱性ポリメラーゼ、あるいはプライマーが細胞内に効率よく取り込まれなければならない。また同時にPCRによって増幅されたDNA断片が細胞外に流出することも防がねばならない。そのためにはまず過剰ではなくかつ不充分ではない組織の固定条件を検討する必要がある。そこで始めに、アルデヒド類による化学固定を濃度、組成、時間等を変えて検討したが、いずれの条件でもまだ充分なシグナルは得られていない。そこで今後は、液体ヘリウム急速凍結法により凍結した試料を、クライオウルトラミクロトームにより凍結切片にして用いることを検討する必要があると考えられる。あるいは凍結後、プログラムフリーザ-を用いて凍結乾燥した試料についても試みる必要がある。

原位杂交方法是一种测试组织中哪些细胞含有并表达目的基因的方法。利用这种方法，我们发现ids3是一种在缺铁时特异性表达的基因，它在大麦根的中心柱附近表达，这与铁在组织中的位置密切相关。然而，除了ids3之外的其他基因的表达水平非常小，以至于无法检测到。因此，我们考虑应用原位PCR方法，通过在组织中进行PCR并扩增DNA来检测微量基因，以阐明铁诱导的与铁营养相关的基因的表达调控的功能，最终目标是建立铁营养相关基因的表达调控机制。使用植物材料进行此操作的最佳条件。在原位PCR方法中，首先对组织切片进行PCR。此后，通过杂交检测组织内扩增的DNA片段。使用地高辛和放射性同位素标记探针进行检测。由于该方法使用组织切片进行 PCR，因此必须将热稳定性聚合酶或引物有效地掺入细胞中。同时，还要防止PCR扩增的DNA片段漏出细胞外。为此，首先需要考虑组织固定条件既不过分也不过分。首先，我们通过改变浓度、组成、时间等研究了使用醛的化学固定，但在任何条件下都没有获得足够的信号。因此，今后有必要考虑使用液氦速冻法冷冻的样品作为冷冻超薄切片机的冷冻切片。或者，还需要尝试使用已冷冻然后使用可编程冷冻机冻干的样品。